上海信帆生物：全新的蛋白相互作用分析工具

在細胞中，蛋白質並不是孤單的個(ge) 體(ti) 。大多數蛋白通過與(yu) 分子伴侶(lv) 或其他蛋白形成複合物而發揮其功能。因此，在了解細胞的生物學特性時，蛋白質相互作用（PPI）研究就成了重要一環。在藥物開發的過程中，這一信息也至關(guan) 重要，有助於(yu) 確認藥物靶點。

一提起蛋白質相互作用研究，你的腦海中可能馬上浮現出：酵母雙雜交、免疫共沉澱等技術。的確，這些都是經典方法，可有效檢測體(ti) 內(nei) 體(ti) 外蛋白質相互作用。然而，它們(men) 不能提供動態的蛋白相互作用信息，似乎還缺乏一些說服力。基於(yu) 此，共振能量轉移這種方法受到人們(men) 的青睞。這種能量轉移有著嚴(yan) 格的距離限製（< 10 nm），特別適合評估蛋白質的相互作用。

它的原理並不複雜，就是兩(liang) 個(ge) 蛋白分子靠近時，激發態能量從(cong) 一個(ge) 熒光基團轉移到另一個(ge) 。生物發光共振能量轉移（BRET）和熒光共振能量轉移（FRET）都屬於(yu) 這種方法。它們(men) 的主要區別在於(yu) ，FRET涉及到兩(liang) 個(ge) 熒光基團之間的能量轉移，其中一個(ge) 需要適當光源的外部激發，而BRET在底物被氧化之後發生，因此不需要外部激發。如此看來，BRET相對FRET有不少優(you) 點，比如無需激發光，背景更低，也避免了光漂白和自發熒光等問題。

BRETzui初是在海洋生物中觀察到的，如水母和海腎。之後，人們(men) 將其用於(yu) 動物和植物研究。在BRET技術中，蛋白A融合螢光素酶（通常是海腎螢光素酶），作為(wei) 能量供體(ti) ，蛋白B則融合帶有熒光基團的標簽蛋白，作為(wei) 能量受體(ti) 。如果蛋白A和B存在相互作用，加入螢光素酶底物後，螢光素酶發光可以激發鄰近的蛋白B的熒光基團發光。如果沒有相互作用，那就沒有熒光咯。

大幅改良的BRET平台

目前，人們(men) 大多使用海腎螢光素酶（Rluc）作為(wei) 能量供體(ti) ，黃色熒光蛋白（YFP）作為(wei) 能量受體(ti) ，在這之間實現能量轉移。然而，Rluc和YFP的光譜接近，產(chan) 生了明顯的背景。這種高背景增加了檢測噪音，也降低了靈敏度和動態範圍。

於(yu) 是，Promega對BRET方法進行大幅改良。它使用NanoLuc® 螢光素酶作為(wei) 能量供體(ti) ，而HaloTag® 蛋白標記的NanoBRET™ 618熒光基團作為(wei) 能量受體(ti) ，帶來了的NanoBRET™ 技術。

集兩(liang) 大於(yu) 一身的NanoBRET™，可不是鬧著玩的。NanoLuc® 螢光素酶的分子量僅(jin) 為(wei) 19 kDa（171個(ge) 氨基酸），更適合於(yu) 構建融合蛋白。別看它小，它的光信號比海腎螢光素酶高兩(liang) 個(ge) 數量級，因此極少量也能準確定量，特別適合細胞水平蛋白相互作用的研究。

至於(yu) 能量受體(ti) ，Promega利用HaloTag® 蛋白標簽技術來構建。在評估了一係列熒光基團之後，他們(men) 選擇了NanoBRET™ 618配基。它與(yu) NanoLuc® 的波長配對更加，使得檢測數據更加出眾(zhong) 。於(yu) 是，來自NanoLuc® 供體(ti) 的明亮的藍移發光信號耦合到遠紅移的HaloTag® 受體(ti) 上後，光譜疊加更佳、信號更強、且與(yu) 傳(chuan) 統的BRET分析相比背景更低。

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