上海信帆生物：聚合酶鏈式反應及其產物分析

實驗原理：PCR擴增是模擬天然DNA複製過程，利用DNA聚合酶在體(ti) 外（試管中）擴增一對引物之間特異性DNA片段的方法。其主要熱循環過程可分為(wei) 三個(ge) 步驟：
　　 （1）高溫變性（denature）：提供DNA複製的有效模板。
　　 （2）低溫退火（anneal）：引物與(yu) 模板DNA複性，提供遊離3’-OH端供DNA複製起始；
　　 （3）中溫延伸（extend）：依賴Mg2+，DNA聚合酶催化合成與(yu) 模板互補的新的DNA分子。
　　以上變性、退火、延伸三個(ge) 過程組成一個(ge) 循環周期；常循環25～40周期，經過n輪循環後，靶DNA的拷貝數理論上呈2n增長；循環進行完畢，通常zui後還在DNA聚合酶zui適溫度下延伸5～10分鍾。
操作步驟：本次實驗程序如下：
　　（1）標記一個(ge) 潔淨的200uL反應管，向其中依次加入：
　　　　ddH2O 36 uL
　　　　10×PCR反應緩衝(chong) 液 5uL
　　　　2mmol/L dNTPs 5uL
　　　　上遊引物 1uL
　　　　下遊引物 1uL
　　　　DNA模板 1uL
　　　　Taq DNA聚合酶 1 uL
　　　　總體(ti) 積：50uL
　　 混合均勻後，蓋緊管蓋，離心5S，使反應成份均勻富集於(yu) 管底。
　　（2） 加石蠟油50～100μl於(yu) 反應液表麵以防蒸發（此步驟根據PCR儀(yi) 而定，如帶高溫熱蓋PCR儀(yi) 不需加入）。
　　（3） 在PCR儀(yi) 上設置反應循環參數，本次實驗為(wei) ：94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，循環數為(wei) 30，zui後於(yu) 72℃充分延伸10 min後終止反應（16℃ 3 min）。
　　（4） 置反應管於(yu) PCR儀(yi) 上進行熱循環。
　　（5） 反應完畢後，常取5～10％反應產(chan) 物（如本次5uL）進行瓊脂糖凝膠電泳，通過溴乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產(chan) 物的質量，正常DNA電泳帶應清晰、整齊，並通過與(yu) 已知分子量大小的DNA標誌物比較，初步了解產(chan) 物大小是否與(yu) 預期吻合。

注意事項：
　　 1. 戴手套操作，避免汙染
　　　2．冰上操作

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