上海信帆生物：PCR實用技巧

增加PCR的特異性：

1. primers design

這是zui重要的一步。理想的，隻同目的序列兩(liang) 側(ce) 的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下麵的 一些條件

1) 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的primer同樣會(hui) 降低特異性,並且降低產(chan) 量

2) GC% 40%~60%

3) 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性

4) 避免3'端GC rich, zui後3個(ge) BASE不要有GC,或者zui後5個(ge) 有3個(ge) 不要是GC (有人說：3' 端是 GC/CG/CC/GG。)

5) 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER

6) 避免3'端的錯配

7) 避免內(nei) 部形成二級結構

8) 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們(men)

9) 使用兼並primer時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼並primer,並使用 較高的primer濃度(1uM-3uM)

10) 學會(hui) 使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online design et al.

* primer的另一個(ge) 重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的primer和互補序列表現為(wei) 雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對於(yu) 設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從(cong) 55℃到70℃。退火溫度一般設定比primer的 Tm低5℃。

設定Tm有幾種公式。有的是來源於(yu) 高鹽溶液中的雜交，適用於(yu) 小於(yu) 18堿基的primer。

有的是根據GC含量估算Tm。確定primerTmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從(cong) 序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測primer的雜交穩定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。

根據所使用的公式及primer序列的不同，Tm會(hui) 差異很大。因為(wei) 大部分公式提供一個(ge) 估算的Tm值，所有退火溫度隻是一個(ge) 起始點。可以通過分析幾個(ge) 逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於(yu) 估算的Tm5℃，以2℃為(wei) 增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(hui) 減少primer二聚體(ti) 和非特異性產(chan) 物的形成。

為(wei) 獲得*結果，兩(liang) 個(ge) primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會(hui) primer在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩(liang) 個(ge) primerTm不同，將退火溫度設定為(wei) 比zui低的Tm低5℃

或者為(wei) 了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度*行5個(ge) 循環，然後在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘(yu) 的循環。這使得在較為(wei) 嚴(yan) 緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

2. stability of primers

定製primer的標準純度對於(yu) 大多數PCR應用是足夠的。

primer產(chan) 量受合成化學的效率及純化方法的影響。定製primer以幹粉形式運輸。在TE重溶primer，使其zui終濃度為(wei) 100μM。TE比去離子水好，因為(wei) 水的pH經常偏酸，會(hui) 引起寡核甘的水解。 primer的穩定性依賴於(yu) 儲(chu) 存條件。應將幹粉和溶解的primer儲(chu) 存在-20℃。以大於(yu) 10μM濃度溶於(yu) TE的primer在 -20℃可以穩定保存6個(ge) 月，但在室溫（15℃到30℃）僅(jin) 能保存不到1周。幹粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個(ge) 月

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