上海信帆生物：如何選擇合適的細胞培養基

細胞培養(yang) 是實驗室裏zui常見和zui基本的實驗了，但卻不是zui簡單的。別小看細胞培養(yang) ，這裏可蘊含著大學問。有時候細胞狀態不好，轉染、藥篩這些實驗根本就沒辦法做。影響細胞培養(yang) 的因素很多，讓我們(men) 先從(cong) 培養(yang) 基和血清說起。

經典的培養(yang) 基有很多種，Invitrogen(GIBCO)、thermo fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應用zui廣泛的培養(yang) 基。其他如M199、IMDM、L15培養(yang) 基等也用於(yu) 某些細胞的培養(yang) 。

◆ MEM是由Eagle’s基礎培養(yang) 基(BME)發展而來的，其中增加了組分的範圍及濃度。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培養(yang) 基是為(wei) 小鼠成纖維細胞設計的，現在常用於(yu) 貼壁細胞的培養(yang) 。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩(liang) 倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩衝(chong) 作用。zui初的配方中葡萄糖含量為(wei) 1000 mg/L，後來為(wei) 了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調整為(wei) 4500 mg/L，這就是大家常說的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸，它可廣泛應用於(yu) 各種細胞類型，包括對營養(yang) 成分要求苛刻的細胞。

◆ Ham’s F12是為(wei) 在低血清濃度下克隆CHO細胞而設計的，現在也廣泛應用於(yu) 克隆形成率的分析及原代培養(yang) 。F12還可以與(yu) DMEM等體(ti) 積混合使用，得到一種高濃度與(yu) 成分多樣化相結合的產(chan) 物，這種培養(yang) 基已應用於(yu) 許多原代培養(yang) 及更難養(yang) 的細胞係的培養(yang) 。

◆ RPMI 1640培養(yang) 基是專(zhuan) 為(wei) 淋巴細胞培養(yang) 而設計的，現在已廣泛應用於(yu) 懸浮細胞的培養(yang) 。

以前經常聽到有人問，這種細胞該用哪一種培養(yang) 基呢?其實這個(ge) 問題的答案可以很簡單，也可以好複雜。此話怎講?如果這種細胞是購自ATCC或其他的細胞庫，那很簡單，問供應商就行了。或者找到相關(guan) 的文獻，作為(wei) 參考。Invitrogen上有一個(ge) Cell Line Database的工具，也很好用。選擇你感興(xing) 趣的細胞類型，它就會(hui) 彈出推薦的培養(yang) 基、血清和轉染試劑等，有時還有優(you) 化好的轉染步驟，很方便。Sigma上也有一個(ge) Media Expert，包括了培養(yang) 基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻等，它還是一個(ge) 解決(jue) 問題能手，對於(yu) 細胞培養(yang) 中的常見問題，如細胞貼壁不好、培養(yang) 基變色等，它都會(hui) 列出可能的原因，並提供補救辦法。這個(ge) Expert果然不簡單!

但如果你是著手建立一種全新細胞的培養(yang) 體(ti) 係，根本找不到任何參考，那你就得花點時間自己試驗了。萬(wan) 事開頭難嘛。因為(wei) 沒有一個(ge) 標準答案。在MEM中培養(yang) 的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做貼壁細胞培養(yang) 、RPMI 1640做懸浮細胞培養(yang) 會(hui) 是一個(ge) 好的開始。你也可以購買(mai) 幾種培養(yang) 基來，然後花大約兩(liang) 周的時間做一個(ge) 簡單的細胞生長實驗，來選擇其中的。有時候你會(hui) 驚訝地發現你的*培養(yang) 條件與(yu) 文獻報道的不同，就算是同一種培養(yang) 條件，細胞的生長狀態也時好時壞，這是很正常的。因為(wei) 試劑、水、不同批號的血清之間都存在著差異。要提高培養(yang) 基的穩定性，可以從(cong) 培養(yang) 基和血清兩(liang) 方麵入手。

以前大部分實驗室都是用幹粉培養(yang) 基，但配製過程就較為(wei) 繁瑣，要溶解、調pH值，過濾，過程中可能會(hui) 產(chan) 生一些濃度誤差，而且有些實驗室的水質並不理想，所以培養(yang) 的效果會(hui) 有差異。如果使用液體(ti) 培養(yang) 基，這種人為(wei) 的誤差會(hui) 減少，因為(wei) 畢竟是大批量工業(ye) 化生物試劑的，批間差會(hui) 很小。大家是不是感覺液體(ti) 培養(yang) 基會(hui) 貴很多，以前是這樣，但現在非也。HyClone和Invitrogen都在國內(nei) 建立了液體(ti) 培養(yang) 基的生物試劑基地，生物試劑和運輸成本大幅降低，所以現在的價(jia) 格也隻是50-60元/500ml，比幹粉培養(yang) 基貴不了多少，而且還幫你省了過濾器和時間。

血清含有生長因子可促進細胞的繁殖，含有附著因子可促進細胞的貼壁，同時還具有抗胰酶活性。血清同時也是礦物質、脂類及激素的來源。zui常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時間的早晚來分類的。采血時間越早，營養(yang) 物質越豐(feng) 富，所含抗體(ti) 也越少，因而胎牛血清適合要求高的細胞係和克隆化培養(yang) 。由於(yu) 瘋牛病的原因，到目前為(wei) 止，我國政府仍然禁止從(cong) 北美洲、歐洲和日本等地區進口牛血清，因此市麵上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產(chan) 的。

而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來源於(yu) 不同的製備方法和除菌方法、動物的年齡差別及血清的儲(chu) 存條件等，而且與(yu) 取血動物的來源關(guan) 係密切。不同的牧場、不同的氣候天氣及其他環境因素都可能影響血清的質量。因此選好了一種血清就要盡可能長期使用它。在需要更換時，也要盡量保持與(yu) 原有的一批血清相似。現在很多公司都提供血清預留，你一旦選定了某個(ge) 批次的血清，備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。

血清固然是細胞培養(yang) 中*的成分，但正如上文所說，血清的批間差異大，更換血清時需要做大量的測試以取保替換的血清與(yu) 原來的相似。而血清的供應也是必須要考慮的因素。由於(yu) 氣候或瘋牛病的影響，說不定哪天血清就突然沒得賣了，那對實驗的影響可非同小可。另外，血清的價(jia) 格也很昂貴，雖說現在也有便宜的國產(chan) 血清，但是高品質的澳洲血清價(jia) 格仍舊高企。因此，也有一些實驗室開始換用無血清培養(yang) 基。

無血清培養(yang) 基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義(yi) ，就是在細胞培養(yang) 中不需要添加血清，但是在某些應用中可能要添加生長因子或細胞因子。無血清培養(yang) 基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長因子、必需的營養(yang) 物質和激素等，能減少上述血清帶來的不利因素，使細胞培養(yang) 的條件更穩定。但它也不是的，從(cong) 有血清培養(yang) 過渡到無血清培養(yang) 的條件並不像想象中那麽(me) 直截了當。處於(yu) 發育的不同分化階段的細胞(例如幹細胞與(yu) 定向前體(ti) 細胞相比)需要不同的配方，對生長因子和細胞因子的選擇尤為(wei) 重要。而且在去除血清的同時，也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀(yi) 器清潔度的要求更高。另外，它的價(jia) 格也比普通的培養(yang) 基貴很多。

現在有很多廠家生物試劑無血清培養(yang) 基。GIBCO這個(ge) 細胞培養(yang) 的金字招牌當然少不了，它也是zui早研製無血清培養(yang) 基的。目前已經開發了ES細胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲細胞、神經細胞、淋巴細胞、角質細胞、內(nei) 皮細胞等多種細胞的無血清培養(yang) 基。上個(ge) 月還推出了*間充質幹細胞的無血清培養(yang) 基，能使MSC維持未分化狀態超過9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細胞、昆蟲細胞、病毒疫苗細胞的多種無血清培養(yang) 基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞(ya) JRH公司，有了JRH的EX-CELL係列，無血清培養(yang) 基的選擇也更多了。

這麽(me) 多種，要選擇起來也是個(ge) 頭疼的事情。除了部分培養(yang) 基是公開配方的，如用於(yu) 培養(yang) 內(nei) 皮細胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液體(ti) 培養(yang) 基都是配方的，也就是說其中的成分是保密的。那麽(me) 你隻能是檢索文獻、讓供應商推薦，然後用自己的細胞做幾次傳(chuan) 代培養(yang) 來選出zui合適的培養(yang) 基。畢竟實踐出真知嘛。

P.S.附上一些細胞培養(yang) 中的小Tip，可能會(hui) 對您有所啟發。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

• 切記，細胞培養(yang) 基的儲(chu) 存條件是2-8攝氏度。如果細胞培養(yang) 基不小心被凍，您應該融化培養(yang) 基並觀察是否有沉澱產(chan) 生。如果沒有沉澱產(chan) 生，培養(yang) 基可以正常使用，如果出現沉澱，隻能丟(diu) 棄這些培養(yang) 基。

• 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yang) 基，可能在放置幾天後顏色變紫。這主要是由於(yu) 在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前鬆開瓶口，在CO2培養(yang) 箱孵育培養(yang) 基10-15分鍾，來校正溶液的pH值(確定鬆開瓶口以保證氣體(ti) 交換)。

• 當在無血清培養(yang) 基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yang) 基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(hui) 結合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yang) 條件下，抗生素不被滅活，可能對於(yu) 細胞達到毒性水平。

• 一旦您在新鮮培養(yang) 基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩(liang) 到三周內(nei) 使用它。因為(wei) 一些抗生素和血清中的基本成分在解凍後就開始降解。

• 總之，大部分添加物和試劑zui多可以凍融3次，如果次數更多都會(hui) 在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉澱，將會(hui) 影響它的性能。

• 血清的熱滅活在免疫分析時可以滅活補體(ti) 係統。在免疫學研究，培養(yang) ES細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，並沒有確鑿的證據說明這樣做是有益的。相反，對大部分細胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為(wei) 加熱可能使血清中的沉澱增加，使您誤以為(wei) 汙染。

• 如何避免血清中沉澱物的產(chan) 生?

1. 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實驗顯示非常容易產(chan) 生沉澱物。並隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。

2. 請勿將血清置於(yu) 37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(hui) 變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會(hui) 因此受到損害，而影響血清的質量。

3. 血清的熱滅活非常容易造成沉澱物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

4. 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鍾的原則，並且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會(hui) 造成沉澱物的增多。

• 在進行傳(chuan) 代培養(yang) 時，我們(men) 強烈推薦進行台盼蘭(lan) 活性記數。研究者常常通過一個(ge) 簡單的稀釋(1∶4或1∶2)進行傳(chuan) 代，不進行活性檢測，您可能接種比你認為(wei) 的低的多的濃度的細胞，這常常可能導致生長緩慢或培養(yang) 物根本不生長。

• 貯存在4℃冰箱中的液體(ti) 胰蛋白酶溶液隻能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鍾，就會(hui) 變得不穩定。

• 在訂購的細胞到達後，應立即複蘇，如果培養(yang) 基還沒有準備好，可將其放入液氮中，盡快複蘇。千萬(wan) 不能放置在-20或-80℃的冰箱內(nei) 。

• 細胞複蘇往往是比較容易出問題的步驟。請在訂購細胞時就向供應商索取詳細的複蘇步驟，並仔細閱讀。有些供應商就不推薦在複蘇時離心，對此類細節，應特別留意。

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