信帆生物分享：ELISA技術測定單克隆抗體效價方法

信帆生物分享：ELISA技術測定單克隆抗體(ti) 效價(jia) 方法

一、實驗目的

1.深入了解elisa 法測定抗體(ti) 效價(jia) 的原理。

2.掌握ELISA 法測定單克隆抗體(ti) 效價(jia) 的方法。

二、實驗原理

ELISA 是以免疫學反應為(wei) 基礎，將抗原、抗體(ti) 的特異性反應與(yu) 酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體(ti) /抗原分子上，形成酶標抗體(ti) /酶標抗原，稱為(wei) 酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反應後，作用於(yu) 底物使之呈色，根據顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體(ti) 。ELISA 法是免疫酶技術的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體(ti) ，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應後都要反複洗滌，這既保證了反應的定量關(guan) 係，也避免了末反應的遊離抗體(ti) /抗原的分離步驟。在ELISA 法中.酶促反應隻進行一次，而抗原、抗體(ti) 的免疫反應可進行一次或數次，即可用二抗(抗抗體(ti) )、三抗再次進行免疫反應。

目前常用的幾種ELISA 方法有：測定抗體(ti) 的間接法，測定抗原的雙抗體(ti) 夾心法和測定抗原的競爭(zheng) 法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體(ti) 效價(jia) 。其主要過程為(wei) ：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內(nei) ，加待測抗體(ti) ，保溫後洗滌以除去未結合的雜蛋白質，加酶標抗抗體(ti) ，保溫後洗滌，加底物保溫30分鍾後，加酸或堿終止酶促反應，用目測或光電比色測定抗體(ti) 含量。

三、儀(yi) 器、原料和試劑

儀(yi) 器

聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯免疫閱讀儀(yi) 、水浴鍋。

原料

單克隆抗體(ti)

試劑

1. 抗原及酶標記抗體(ti)

①抗原：兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG，Code No.A0423);

②酶標抗抗體(ti) ：兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP，Code No.P0260);均為(wei)

DAKO 公司產(chan) 品，使用時按照說明書(shu) 要求稀釋。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS)：1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白，0.1%Tween 20的PBS)：10mLPBS 中加入100mgBSA，10μLTween-20。

6. 底物溶液

①磷酸鈉鹽緩衝(chong) 液(0.1mol/LpH6.0)：稱Na2HPO4·12H2O2.2g，NaH2PO4·2H2O 6.84g，用蒸餾水溶解，定容至500mL。

② TMB 貯液：稱60mgTMB 溶於(yu) 10mL 二甲基亞(ya) 碸中，4℃避光保存。

③底物應用液：現用現配，磷酸鈉緩衝(chong) 液10mL，TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL，混勻。

7. 終止液：2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為(wei) 抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板

中。4℃放置過一夜。

②洗滌：次日傾(qing) 去凹孔內(nei) 的液體(ti) ，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h。

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體(ti) 的細胞培養(yang) 上清在另—塊板上用PBS 連續稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到已包被的板上，每個(ge) 樣品平行做兩(liang) 份，PBS 或空白培養(yang) 基作為(wei) 陰性對照，已知樣品作為(wei) 陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體(ti) ：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL/孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配製的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。

⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀(yi) 測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應的zui大稀釋度為(wei) 待測樣品的效價(jia) 。

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