ELISA實驗：在ELISA實驗技術中的抗原抗體反應

ELISA實驗：在ELISA實驗技術中的抗原抗體(ti) 反應

1. 抗體(ti) 的結構

抗體(ti) 是能與(yu) 抗原特異性結合的免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)。Ig 分五類，即IgG、IgA 、IgM、IgD 和IgE。與(yu) 免疫測定有關(guan) 的Ig 主要為(wei) IgG 和IgM。Ig 由兩(liang) 個(ge) 輕鏈(L)和兩(liang) 個(ge) 重鏈(H)的單體(ti) 組成。Ig 的輕鏈是相同的，有κ(kappa)和λ(Lambda )兩(liang) 種型別。五類Ig 的重鏈結構不同，這決(jue) 定了它們(men) 的抗原性也不同。IgG 和IgM 的重鏈分別稱為(wei) γ(gamma )鏈和μ(mu )鏈。重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體(ti) 而異，稱為(wei) 可變區，分別用VH 和VL 表示。兩(liang) 者構成抗體(ti) 的抗原結合部位，隻與(yu) 相應的抗原決(jue) 定簇匹配，發生特異性結合，是抗體(ti) 專(zhuan) 一性結合抗原的結構基礎。

IgG 可被木瓜蛋白酶分解為(wei) 三個(ge) 區段，其中兩(liang) 個(ge) 相同的區段稱抗原結合片段(Fab )。每個(ge) Fab 都保存結合抗原的能力，但隻有一個(ge) 抗原結合位點，是單價(jia) 的，與(yu) 抗原結合後不出現凝集或沉澱。另一區段稱Fc 段，無抗體(ti) 活性，但具有IgG *的抗原性。

IgG 可被胃蛋白酶分解為(wei) 兩(liang) 個(ge) 片段，一個(ge) Fab 雙體(ti) ，稱F(ab’)2，能和兩(liang) 個(ge) 相同的抗原結合;另一片段類似Fc，隨後被分解成小分子多肽，無生物活性。

IgM 是由五個(ge) 單體(ti) 組成的五聚體(ti) ，含 10 個(ge) 重鏈和10 個(ge) 輕鏈，具有10 個(ge) 抗原結合價(jia) ，由於(yu) 空間位置的影響，隻表現為(wei) 五個(ge) 抗原結合價(jia) 。IgM 分子量約為(wei) 900000， IgG 分子量約為(wei) 150000 。

機體(ti) 被微生物感染後，先產(chan) 生 IgM 抗體(ti) ，然後產(chan) 生IgG 抗體(ti) 。經過一段時間，IgM 抗體(ti) 量逐漸減少而消失，而IgG 抗體(ti) 可長期存在，在疾病*後可持續數年之久。IgM 抗體(ti) 一般為(wei) 保護性抗體(ti) 具有免疫性。因此IgM 抗體(ti) 的測定，對某些傳(chuan) 染病如甲型肝炎有較高的研究診斷價(jia) 值。右圖為(wei) 為(wei) 甲型肝炎病科研血清中IgG 抗體(ti) 和IgM 抗體(ti) 出現的時間和水平。

2. 抗原抗體(ti) 反應

2.1 可逆性

Ag·Ab 的解離程度與(yu) K 值有關(guan) 。高親(qin) 和力抗體(ti) 的抗原結合點與(yu) 抗原的決(jue) 定簇在空間構型上非常適合，兩(liang) 者結合牢固，不易解離。解離後的抗原或抗體(ti) 均能保持原有的結構和活性，因此可用親(qin) 和層析法來提純抗原或抗體(ti) 。在抗血清中，特異性的IgG 抗體(ti) 僅(jin) 占總IgG 中的極小部分。用親(qin) 和層析法提取的特異性抗體(ti) ，稱為(wei) 親(qin) 和層析純抗體(ti) ，應用於(yu) 免疫測定中可得到更好的效果。

2.2 zui適比例

在恒定量的抗體(ti) 中加入遞增量的抗原形成抗體(ti) 複合物(沉澱)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體(ti) 比例zui合適的範圍，稱為(wei) 等價(jia) 帶(zone of equivalence )。在等價(jia) 帶前後分別為(wei) 抗體(ti) 過剩帶和抗原過剩帶。

如果抗原或抗體(ti) 極度過剩，則無沉澱物形成，在免疫測定中稱為(wei) 帶現象(zone phenomenon )。抗體(ti) 過量稱為(wei) 前帶(prezone)，抗原地過量稱為(wei) 後帶(postzone)。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應係統中有足夠的抗體(ti) 量，否則測得的量會(hui) 小於(yu) 實際含量，甚至出現假陰性。

2.3 特異性

抗原抗體(ti) 的結合實質上隻發生在抗原的抗原決(jue) 定簇與(yu) 抗體(ti) 的抗原結合位點之間。由於(yu) 兩(liang) 者在化學結構和空間構型上呈互補關(guan) 係，所以抗原抗體(ti) 反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表麵抗原( HBsAg )、e 抗原(HBeAg)和核心抗體(ti) (HBcAg)，隨來源於(yu) 同一病毒，但僅(jin) 與(yu) 其相應的抗體(ti) 結合，而不與(yu) 另外兩(liang) 種抗體(ti) 反應。抗原抗體(ti) 反應的這種特異性使免疫測定能在一非常複雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是的。假使兩(liang) 種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體(ti) 反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促性腺激素( hCG)和黃體(ti) 生成激素(LH)均由α和β兩(liang) 個(ge) 亞(ya) 單位組成，其結構的不同處在β亞(ya) 單位，而兩(liang) 者的α亞(ya) 單位是同類的。用hCG 免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG 和抗β-hCG 兩(liang) 種抗體(ti) ，抗α-hCG 抗體(ti) 將與(yu) LH 中的α酶位發生交叉反應。在研究檢驗中，如用抗hCG 抗血清作為(wei) 妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，隻能用於(yu) hCG 濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH 將與(yu) 之發生交叉反應。因此在作為(wei) 早孕診斷(敏感度應達到50mIu/mlhCG )的實際中必須應用隻對hCG 特異的抗β-hCG，以避免與(yu) 其它激素的交叉反應的發生。

2.4 敏感性

在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為(wei) mg/ml 水平，酶反應測定法的敏感度約為(wei) 5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與(yu) 酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達ng/ml 水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng /ml。

3. 免疫測定在研究檢驗中的應用

由於(yu) 各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以製備特異性的抗血清或單克隆抗體(ti) ，利用此抗體(ti) 作為(wei) 試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用範圍極廣，在研究檢驗中可用於(yu) 測定：

1) 體(ti) 液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體(ti) 激素等。

3) 抗生素和藥物。

4) 病原體(ti) 抗原，HBsAg、HBeAg 等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體(ti) ，例如抗-HBs 等。

4.標記的免疫測定

如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體(ti) 反應後直接測定形成的沉澱或濁度，敏感度可達 5~10μg/ml，但在研究檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低於(yu) 這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體(ti) 用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為(wei) 放射性核素和酶，zui後用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉澱物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與(yu) 待測物*反應。以標記抗體(ti) (Ab ※)檢測抗原(Ag)為(wei) 例，反應式如下：

Ag+ Ab※→ AgAb※+ Ab※

在反應產(chan) 物中有與(yu) Ag 結合的Ab※和遊離和Ab※ ，如不將兩(liang) 者分離而測定標記物，測得的結果將為(wei) 兩(liang) 者之和。因此，遊離標記物與(yu) 結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可采用多種手段，固相載體(ti) 是其中之一。如將抗原或抗體(ti) 包被在固相載體(ti) 上，然後再與(yu) 標記的抗原或抗體(ti) 直接反應，結合的標記物被固定在載體(ti) 上，而遊離的標記物留於(yu) 溶液中。這樣可以通過洗滌將遊離的Ab ※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。

5.酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay )可分為(wei) 均相(homogenous)和非均相(heterogenous )兩(liang) 種類型。

在均相EIA 中可不需進行遊離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體(ti) 反應後形成的酶標記抗原抗體(ti) 複合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映遊離的酶標記物。均相EIA 在研究檢驗中較少應用。非均相EIA 需*行遊離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體(ti) 可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971 年zui初建立時稱為(wei) 酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay )，簡稱ELISA ，在國內(nei) 有譯作酶聯免疫吸附試驗的，雖然含義(yi) 不*確切，但已習(xi) 用。

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