信帆生物為大家分享：RNA提取注意事項

信帆生物為(wei) 大家分享：RNA提取注意事項

RNA提取注意事項

一些RNA提取方法，在進行具體(ti) 實驗時，應根據研究對象的性質，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。

1、 在核酸提取時，為(wei) 了增加細胞的裂解度，增加核蛋白複合體(ti) 破碎度，以釋放更多的遊離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶k，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應時間越長越好。

2、有時在使用蛋白酶時，為(wei) 了抑製核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩衝(chong) 液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，並且可將反應溫度提高到50-60℃，並將反應時間縮短到15-25min，但酶用量必須提高10-20倍。溶菌酶使用時緩衝(chong) 液中需加EDTA，因遊離金屬離子對酶有抑製。

3、許多植物材料中富含酚，在細胞破碎時，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的幹撓可能有所幫助。PVP將與(yu) 酚形成複雜的聚合體(ti) ，在提取時將酚從(cong) 核酸成分中遊離。且PVP與(yu) 巰基乙醇作為(wei) 強還原劑可防止多酚的褐變。另外作為(wei) 還原劑的這些成分在一定程度上可抑製核酸水解酶的作用。

4、 許多生物材料在提取核酸時，都會(hui) 遇到多糖的汙染問題，具體(ti) 表現為(wei) 有機溶劑沉澱時，沉澱很多，但複溶時，大量沉澱不溶，電泳觀察時核酸含量很低。

克服多糖汙染可采用以下一些辦法

1) CTAB多次抽提。

2) 在有機溶劑沉澱時先稀釋樣品濃度(可到10倍左右)，對低濃度樣品再進行沉澱。

3)在有機溶劑沉澱時選用異丙醇和5MNaCL作為(wei) 沉澱溶劑，此時氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體(ti) 積，異丙醇可用到0.6-1的體(ti) 積。異丙醇沉澱核酸時，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從(cong) 而可達到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(hui) 影響核酸的進一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。

5、在核酸提取時，酚與(yu) 氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強於(yu) 氯仿，但酚與(yu) 水有一定的互溶，因此酚抽後，除可能損失部分核酸外，水相中還會(hui) 殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應產(chan) 生強的抑製，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚後在有機溶劑沉澱時一定要用氯仿從(cong) 抽提。

6、 在操作中當加入變性劑氯仿後，為(wei) 了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時，更要避免劇烈操作。

7、 在沉澱核酸時可用乙醇與(yu) 異丙醇，乙醇的極性要強於(yu) 異丙醇，所以一般用2V乙醇沉澱，但在多糖、蛋白含量高時，用異丙醇沉澱可部分克服這種汙染，尤其用異丙醇在室溫下沉澱對擺脫多糖、雜蛋白汙染更為(wei) 有效。

8、 在提取核酸時，如樣品濃度低，則應增加有機溶劑沉澱時間，-70℃下>30min;-20℃過一夜將有助於(yu) 增加核酸的沉澱量。

9、 在核酸提取過程中有機溶劑沉澱後複溶時可加水因此時離子濃度可能較高，而到高度純化後低溫保存時複溶於(yu) TE緩衝(chong) 液中，因溶於(yu) TE的核酸儲(chu) 藏穩定性要高於(yu) 水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。

10、 核酸提取後可通過PCR 、RT-PCR直接擴增出目的基因片斷，也可首先構建文庫、然後由RACE、dd-PCR等差異顯示技術、AFLP等標記技術、差異雜交或文庫扣除技術等方法篩選出特異探針，再用此探針從(cong) 文庫中篩選出完整基因。

11、 在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數.提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要盡可能的短。

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針對酶的一些注意事項

防止RNA酶汙染的措施：

1、 所有的玻璃器皿均應在使用前於(yu) 180℃的高溫下幹烤6hr或更長時間。

2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿衝(chong) 洗(注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用)。

3、 有機玻璃的電泳槽等，可先用去汙劑洗滌，雙蒸水衝(chong) 洗，乙醇幹燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水衝(chong) 洗，晾幹。

4、 配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。

5、 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。

6、 設置RNA操作實驗室，所有器械等應為(wei) 。

7、 DEPC能與(yu) 胺和巰基反應,因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

8、 加樣原則是DNAzui後加，其他試劑按照體(ti) 積大小從(cong) 大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話隻是DNA不同，那麽(me) 采取的方法是算出總體(ti) 積後加在一個(ge) 管子裏麵，混合均勻之後再分裝到各個(ge) 管子裏去，這樣可以有效地避免誤差及汙染。

9、 普通實驗室容易汙染，且汙染程度很高，與(yu) 跑電泳還有質粒製備提取都在同一個(ge) 房間裏有比較大的關(guan) 係，zui容易造成高濃度汙染的就是產(chan) 物的開蓋和質粒的稀釋。因此要格外注意一些。

常用的RNA酶抑製劑：

1、 焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一種強烈但不*的RNA酶抑製劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從(cong) 而抑製酶的活性。

2、 異硫氰酸胍：目前被認為(wei) 是zui有效的RNA酶抑製劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從(cong) 核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3、 氧釩核糖核苷複合物：由氧化釩離子和核苷形成的複合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能*抑製RNA酶的活性。

4、 RNA酶的蛋白抑製劑(RNasin)：從(cong) 大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭(zheng) 性抑製劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5、其它：SDS、尿素、矽藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。因為(wei) DEPc不加選擇的修飾蛋白質和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與(yu) 一些緩衝(chong) 液(例如Tri)不能相容在所有RNA實驗中，zui關(guan) 鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的汙染。

附確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法：

按照樣品濃度，從(cong) RNA溶液中吸取兩(liang) 份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩衝(chong) 液補充到10ul的總體(ti) 積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。取出兩(liang) 份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩(liang) 者的電泳條帶。如果兩(liang) 者的條帶一致或者無明顯差別，則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶汙染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶汙染。

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