信帆生物為您分享：MTT實驗Z全指南

信帆生物為(wei) 您分享：MTT實驗zui全指南

一、MTT是什麽(me)

MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為(wei) 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為(wei) 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。

二、mtt法用來做什麽(me)

簡單地說：是一種檢測細胞存活和生長的方法。

MTT主要有兩(liang) 個(ge) 用途

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體(ti) 外培養(yang) 的細胞毒性的測定;

2.細胞增殖及細胞活性測定。

三、為(wei) 何MTT可以用來做上述工作

檢測原理為(wei) 活細胞線粒體(ti) 中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為(wei) 水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞(ya) 碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀(yi) 在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數範圍內(nei) ，MTT結晶形成的量與(yu) 細胞數成正比。根據測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。

四、實驗所需材料

1.MTT 溶液的配製 通常MTT 配成的終濃度為(wei) 5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市麵上一般MTT的包裝為(wei) 100mg,250mg或1g

1.1對於(yu) 100mg這樣的小包裝，廠家都是將MTT放入小管中的，個(ge) 人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配製成溶液，如100mg用20mlPBS來溶解。 具休做法：預先在50ml離心管(沒有的話，可用培養(yang) 瓶替代)加入20ml PBS，從(cong) 中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中，吹打若幹次後將其移入50ml離心管，然後再混勻。可以重複幾次，以使小管中的MTT不殘留於(yu) 管內(nei) 。將MTT*混勻後，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裏的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙、錫箔紙包住)可長期保存於(yu) -20度。按細胞培養(yang) 板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml，所以分裝時可考慮每管分裝1ml。

1.2對於(yu) 大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解，也有人將粉劑分裝在EP管裏，用的時候現配，直接往培養(yang) 板中加。

注意事項：

l在配製和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。

l配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感

lMTT一般現用現配，過濾後4度避光保存兩(liang) 周內(nei) (個(ge) 人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯)有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反複凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。當MTT變為(wei) 灰綠色時就不能再用。

lMTT有致癌性，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.

2.MTT甲瓚溶解液

2.1二甲基亞(ya) 碸DMSO，可以直接溶解，無需配製，使用方便，溶解速度快，但對人體(ti) 毒性較大，且需去除原培養(yang) 液，在去除培養(yang) 液的過程中，可能會(hui) 把結晶去掉，導致結果不穩定。

2.2三聯溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液(文獻方法：周建軍(jun) 等，評價(jia) 抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫藥工業(ye) 雜誌，1993，24(10)：455-457)，該溶解液不需去除原培養(yang) 基，但溶解較慢。(個(ge) 人覺得其溶解的能力不如DMSO強)

該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chan) 生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解後再使用。

五、MTT法實驗步驟

1: 胰酶消化對數期細胞，終止後離心收集，製成細胞懸液，細胞計數調整其濃度至5-10×104/ml。

細胞詳細計數方法請參照易生物實驗技術中的相關(guan) 文章。

對於(yu) 初學者而言，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從(cong) 何處著手，我在這裏向大家提供一個(ge) 簡單的方法以初步確定細胞數量。

以一般細胞培養(yang) 常用的25cm2為(wei) 例，

1)細胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為(wei) 80%~90%密度時細胞的大致狀態)，消化離心收集後，將上清去掉，加入3ml培養(yang) 基使其混勻。

2)另取一支新的15ml無菌離心管(為(wei) 下一步接種96孔板用)，裝入約9ml培養(yang) 基.

3)從(cong) *步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管，混勻後細胞計數，此時一般為(wei) 或小於(yu) 5-10×104/ml，該濃度相當於(yu) 細胞計數板4個(ge) 大格內(nei) 每大格平均5-10個(ge) 細胞(見下圖);如果不夠該濃度，再根據計數的結果滴加細胞懸液，每滴按50ul計算。

4)細胞數量因實驗目的不同應做相應調整，如一般細胞增殖實驗每孔2000個(ge) 就可以(相當於(yu) 細胞懸液密度為(wei) 2×104/ml)，細胞毒性實驗每孔5000—10000個(ge) (相當於(yu) 細胞懸液密度為(wei) 5×104/ml)。此外，還應根據細胞本身特性，如生長快慢，來決(jue) 定細胞數量。比如：生長較快的細胞密度可略小。

2.將細胞懸液製備好後，輕輕混勻，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為(wei) 5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。

l注意：因細胞在混勻後仍要繼續沉降，因此接種的過程中要反複多次混勻，如每加6個(ge) 孔就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對於(yu) MTT的結果至關(guan) 重要。

3.將接種好的細胞培養(yang) 板放入培養(yang) 箱中培養(yang) ，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁後即可加藥，或兩(liang) 小時，或半天時間，但我們(men) 常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(ge) 梯度,每孔100ul,設3-5個(ge) 複孔.建議設6個(ge) ，否則難以反應真實情況。下圖可做為(wei) 96孔板的的參考步局。

l對於(yu) 加藥，有人直接將藥物按不同體(ti) 積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為(wei) 應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好，然後將96孔板中的培養(yang) 上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yang) 基，這樣能保證藥物濃度的準確。另外，需注意的是，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yang) 液全部吸走後再加藥，應該吸完一部分後立即加樣，避免由於(yu) 96孔板幹燥引起細胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為(wei) 一典型的藥物梯度為(wei) 細胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養(yang) 4h。若藥物與(yu) MTT能夠反應，可先離心後棄去培養(yang) 液，小心用PBS衝(chong) 2-3遍後，再加入含MTT的培養(yang) 液。

6. 終止培養(yang) ，準備溶解結晶。

l 溶解結晶的方法有兩(liang) 種，*種，用DMSO溶解

1) MTT加入培養(yang) 4h後，結晶可充分形成。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走。有人直接用移液器將上清移走，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌麵，然後將96孔板輕輕倒置，這樣上清便被濾紙吸走，以減少結果的損失。個(ge) 人認為(wei) ，這兩(liang) 種方法都有可能導致結晶的損失，從(cong) 而引起結果的不準確。采用哪種方法，可以自己摸索一下再決(jue) 定。

2) 每孔加入150ul二甲基亞(ya) 碸，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀(yi) OD490nm處測量各孔的吸光值。

l 另一種方法，用三聯溶解液(見上麵MTT甲瓚溶解液)

1) MTT加入培養(yang) 4h後，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產(chan) 生結晶，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解後再使用。)

2) 放入培養(yang) 箱中繼續孵育4—6小時，鏡下觀察，待結晶全部溶解後570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會(hui) 全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會(hui) 短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會(hui) 長一些。

在實際的操作過程中，往往為(wei) 了等待4—6小時，使得實驗者在下班以後或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便。個(ge) 人曾經摸索，加入溶解液後過一夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光，不過培養(yang) 箱關(guan) 閉後本身就是閉光的，所以加入溶解液後放入培養(yang) 箱中，第二天上班時再測OD值就可以了。

7、同時設置調零孔(培養(yang) 基、MTT、二甲基亞(ya) 碸)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yang) 液、MTT、二甲基亞(ya) 碸)。

六、MTT結果分析

關(guan) 於(yu) 如何計算IC50

1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg zui大劑量

I:lg(zui大劑量/相臨(lin) 劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:zui大陽性反應率

Pn:zui小陽性反應率

舉(ju) 個(ge) 例子：各藥物濃度作用於(yu) 某腫瘤細胞後所得MTT值如下

藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125 0
OD均值
0.080 0.093 0.236 0.374 0.441 0.531 0.614
公式中的zui大zui小陽性反應率就是zui大zui小抑製率

抑製率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對於(yu) 100ug/ml的藥物，其抑製率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑製率如下：

藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125
抑製率
0.869 0.849 0.616 0.391 0.282 0.135
代入計算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

該藥物的IC50值為(wei) 45.186ug/ml