信帆生物代做：EMSA實驗，解析EMSA實驗常見問題分析

信帆生物代做：EMSA實驗，解析EMSA實驗常見問題分析

1. 什麽(me) 是凝膠遷移或電泳遷移率實驗?

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關(guan) 的DNA結合序列相互作用的技術，可用於(yu) 定性和定量分析。這一技術zui初用於(yu) 研究DNA結合蛋白，目前已用於(yu) 研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離複合物和非結合的探針。DNA複合物或RNA複合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭(zheng) 實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異)，和其它非相關(guan) 的片段(非特異)，來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭(zheng) 的特異和非特異片段的存在下，依據複合物的特點和強度來確定特異結合。

2. 實驗中需要用到什麽(me) 試劑?

凝膠遷移實驗需要的結合蛋白，可來源於(yu) 純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必須製備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體(ti) RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體(ti) 外合成。Promega公司的Riboprobe/sup係統(a,b)可用於(yu) 同位素標記的RNA的體(ti) 外合成，DNA 5'末端標記係統，用於(yu) 製備DNA探針，結合反應所需的組分有：含鹽的溶液(氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀)、緩衝(chong) 體(ti) 係(Tris-HCl或HEPES)、還原劑(DTT)、甘油、非特異的競爭(zheng) DNA(poly(dI:dC)dI:dC)，也可能含非離子去汙劑。在結合蛋白和同位素標記的探針作用後，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離複合物，隨後將凝膠幹燥並放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。

3. 凝膠遷移實驗係統提供了什麽(me) 試劑?

Promega公司提供一種凝膠遷移實驗係統檢測DNA結合蛋白，係統可作為(wei) 這類實驗的一種陽性對照。係統包括目的寡核苷酸，對照DNA結合蛋白，結合緩衝(chong) 液，用於(yu) 寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。Core 係統包括含重組AP2蛋白(AP2抽提液)的大腸杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從(cong) 表達AP2蛋白的大腸杆菌中提取的。另外，Core係統還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結合緩衝(chong) 液，和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete係統含另外5個(ge) 雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、nf-kb、 TFIID結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記後用作特異性探針，或在競爭(zheng) 實驗中用作非特異性探針。

4. 成功進行凝膠遷移實驗，需要優(you) 化哪些因素?

凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優(you) 化一些參數，這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。以下是需要優(you) 化的因素：抽提液的製備(核酸酶和磷酸酶汙染會(hui) 使探針降解)，結合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩衝(chong) 液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體(ti) 蛋白，是否有輔助因子(比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素)。總之，反應總體(ti) 積應zui小(20μl)。為(wei) 滿足一般要求，結合緩衝(chong) 液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES(pH7.9)， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為(wei) 優(you) 化實驗的起始。

5. 在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素?

目的DNA的長度應小於(yu) 300bp，以有利於(yu) 非結合探針和蛋白DNA複合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限製性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應用短的寡核苷酸片段(約為(wei) 25bp)，這樣結合位點可和其他因子的結合位點區別開。長的限製性酶切片段可用於(yu) 對推定的啟動子/增強子區域內(nei) 的蛋白結合位點定位。隨後可用DNaseI印跡對蛋白結合的特異區域在DNA序列水平上作出分析。

6. 用以下一些轉錄調節因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些複合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當用HeLa細胞核抽提物作為(wei) 結合蛋白的來源時，每1個(ge) 轉錄調節因子和它相關(guan) 的DNA同源序列結合形成特征型的結合形態。以下的文字描述了每一個(ge) 單獨的轉錄調節因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的複合物的數目。

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