凝膠遷移電泳遷移率實驗（EMSA）實驗流程

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一 探針的標記

1 如下設置探針標記的反應體(ti) 係：

(1)待標記探針(1.75 pmol/微升)：2微升。

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X)：1微升。

(3)Nuclease-Free Water：5微升。

(4)[γ-32P]atp(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml)：1微升。

(5)T4 Polynucleotide Kinase(5-10 u/微升)：1微升。

(6)總體(ti) 積10微升。

(7)按照上述反應體(ti) 係依次加入各種試劑，加入同位素後，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻。

2 使用水浴或PCR儀(yi) ，37℃反應10分鍾。

3 加入1微升探針標記終止液，混勻，終止探針標記反應。

4 再加入89微升TE,混勻。此時可以取少量探針用於(yu) 檢測標記的效率。通常標記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標 記到了探針上。為(wei) 實驗簡便起見，通常不必測定探針的標記效率。

5 標記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。

二 探針的純化

通常為(wei) 實驗簡便起見，可以不必純化標記好的探針。在有些時候，純化後的探針會(hui) 改善EMSA的電泳結果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：

1 對於(yu) 100微升標記好的探針，加入1/4體(ti) 積即25微升的5 M醋酸銨，再加入2體(ti) 積即200微升的無水乙醇，混勻。

2 在-70℃至-80℃沉澱1小時，或在-20℃沉澱過一夜。

3 在4℃，12 000 g-16 000 g離心30分鍾。小心去除上清，切不可觸及沉。

4 在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鍾。小心吸去殘餘(yu) 液體(ti) 。微晾幹沉澱，但不宜過分幹燥。

5 加入100微升TE,*溶解沉澱。標記好的探針立即使用，zui長使用時間一般不宜超過3天。標記好的探針可以保存在-20℃。

三 EMSA 膠的配製

1 準備好倒膠的模具。可以使用常規的灌製蛋白電泳膠的模具，或其它適當的模具。選擇可以灌製較薄膠的模具，以便於(yu) 幹膠等後續操作。為(wei) 得到更好的結果，可以選擇可灌製較大 EMSA 膠的模具。

2 按照如下配方配製20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結果影響不大)。

(1)TBE buffer(10X)：1毫升。

重蒸水 16.2毫升。

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w)：2毫升。

(3)80甘油：625微升。

(4)10% 過硫酸銨(ammonium persulfate)：150微升。

(5)TEMED：10微升。

按照上述次序加入各個(ge) 溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED後立即混勻，並馬上加入到製膠的模具中。避免產(chan) 生氣泡， 並加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡，可以把一塊製膠的玻璃板進行矽烷化處理。

四 EMSA結合反應

1. 如下設置EMSA結合反應。

1.1 陰性對照反應：

(1)Nuclease-Free Water :7微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結合緩衝(chong) 液(5X)：2微升。

(3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子：0微升。

(4)標記好的探針：1微升。

(5)總體(ti) 積：10微升。

1.2 樣品反應：

(1)Nuclease-Free Water ：5微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結合緩衝(chong) 液(5X)：2微升。

(3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

(4)標記好的探針：1微升。

(5)總體(ti) 積：10微升。

1.3 探針冷競爭(zheng) 反應：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結合緩衝(chong) 液(5X)：2微升。

(3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

(4)未標記的探針：1微升。

(5)標記好的探針：1微升。

(6)總體(ti) 積：10微升。

1.4 突變探針的冷競爭(zheng) 反應：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結合緩衝(chong) 液(5X)：2微升。

(3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

(4)未標記的突變探針：1微升。

(5)標記好的探針：1微升。

(6)體(ti) 積：10微升。

1.5 Super-shift反應：

(1)Nuclease-Free Water：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結合緩衝(chong) 液(5X)：2微升。

(3)細胞核蛋白或純化的轉錄因子：2微升。

(4)目的蛋白特異抗體(ti) ：1微升。

(5)標記好的探針：1微升。

(6)總體(ti) 積 :10微升。

2 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標記好的探針前先混勻，並且室溫(20-25℃)放置10分鍾，從(cong) 而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合，或者讓冷探針優(you) 先反應。然後加入標記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鍾。

3 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩衝(chong) 液(無色，10X)，混勻後立即上樣。注意：有些時候溴酚藍會(hui) 影響蛋白和DNA的結合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩衝(chong) 液。如果對於(yu) 使用無色上樣緩衝(chong) 液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩衝(chong) 液裏麵添加極少量的藍色的上樣緩衝(chong) 液，至能觀察到藍顏色即可。

五 電泳分析

1 用0.5XTBE作為(wei) 電泳液。按照10V/厘米的電壓預電泳10分鍾。預電泳的時候如果有空餘(yu) 的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩衝(chong) 液(藍色)，以觀察電壓是否正常進行。

2 把混合了上樣緩衝(chong) 液的樣品加入到上樣孔內(nei) 。在多餘(yu) 的某個(ge) 上樣孔內(nei) 加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩衝(chong) 液 (藍色)，用於(yu) 觀察電泳進行的情況。

3 按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 衝(chong) 液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處，停止電泳。

4 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦幹膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩(liang) 塊膠板中的上麵一塊(注：通常選擇先移走矽烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從(cong) EMSA膠的一側(ce) 逐漸覆蓋住整個(ge) EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕後(大約不足1分鍾)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會(hui) 被濾紙一起揭起來。把濾紙側(ce) 向下，放平，在EMSA膠的上麵覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

5 幹膠儀(yi) 器上幹燥EMSA膠。然後用X光片壓片檢測，或用其它適當儀(yi) 器設備檢測。