PCR擴增反應三部曲以及DNA（靶序列）的製備的步驟

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體(ti) 外擴增特異性DNA片段的技術。它可以在體(ti) 外特異地對目的基因進行大量擴增，其巧妙之處在預先設計合成二段分別與(yu) 待測目的基因二端互補的引物，以起到指向定點的作用；再借助於(yu) DNA聚合酶催化的若幹次擴增反應後，即可使特定的基因片段成百萬(wan) 倍的擴增。擴增反應分三步：
①變性：當通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。
②褪火：當溫度突然降低時由於(yu) 模板分子結構較引物要複雜得多，而且反應體(ti) 係中引物DNA量大大多於(yu) 模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會(hui) 較少。
③延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的條件下，
以引物為(wei) 起始點，從(cong) 5′→3′催化的DNA鏈延伸反應。
以上3步為(wei) 一個(ge) 循環，每一循環的產(chan) 物可以作為(wei) 下一循環的模板，若幹次循環之後，介於(yu) 兩(liang) 個(ge) 引物之間的特異性DNA片段就得到了大量的複製，數量可達2×107～8拷貝，PCR的實驗操作包括模板DNA(或RNA)的製備、引物的設計合成、酶促聚合反應、反應產(chan) 物的檢測等。
操作步驟
模板DNA(靶序列)的製備
進行PCR擴增反應的模板可以是人體(ti) 組織細胞的染色體(ti) DNA，微生物的DNA，或是由mRNA反轉錄而成的cDNA等。本實驗用小鼠肝髒製備染色體(ti) DNA作為(wei) PCR擴增的模板。
1. 取肝組織0.5g加入2ml裂解液。
2. 冰浴勻漿。
3. 取勻漿液200μl加入裂解液200μl。
4. 加入蛋白酶k至終末濃度為(wei) 100μg/ml。
5. 以上溶液在65℃保溫數小時或過一夜，不時震搖。
6. 加入75μl 8M KAC，混勻。
7. 在4℃放置15分鍾。
8. 加入750μl氯仿。
9. 經充分震搖後5 000rpm、離心5分鍾，將上清液轉入一新的Eppenderf管，沉澱棄去。
10. 加入750μl無水乙醇，充分混勻，-20℃靜置30分鍾。
11. 12 000rpm、離心10分鍾，棄去上清，沉澱用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm、再離心5分鍾，棄去上清，於(yu) 室溫將有DNA沉澱的Eppendorf管敞開15～30分鍾，使痕量乙醇揮發。
12. 將DNA沉澱團塊溶於(yu) 100μl TE緩衝(chong) 液，加RNA酶1μl，在37℃水浴放置30分鍾。
13. 用等體(ti) 積的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清，加入1/10體(ti) 積的NaAc(pH4.8)和2倍體(ti) 積的無水乙醇，混勻。
15. 12 000rpm、離心10分鍾，棄去上清，沉澱用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm，再離心5分鍾，棄去上清，於(yu) 室溫將有DNA沉澱的Eppendorf管敞開15～30分鍾，使痕量乙醇揮發。溶於(yu) 50μl TE。
16. 取1μl樣品用500μl雙蒸水稀釋，在260nm和280nm處測定吸光度。鑒定樣品純度並計算其含量。
17. 將DNA溶液保存於(yu) -20℃備用。