上海信帆生物：幹細胞研究*分享經驗：如何分選幹細胞

zui早研究人員是在1997年發現了急性髓係白血病（AML）血液樣品中的癌症幹細胞，但是由於(yu) 采用表麵標記物證明實體(ti) 腫瘤中癌症幹細胞的存在，常常會(hui) 出現不一致的結果，因此這一理論也引發了激烈的討論。但是近年來科學家們(men) 在所有癌症類型（膠質母細胞瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中發現了具有自我更新能力，啟動腫瘤發生的細胞，因此討論不再圍繞著“癌症幹細胞是否存在？"了，而是變成了“癌症幹細胞的類型有多少種？"

要想了解癌症幹細胞並不容易，其中一大阻礙就是癌症幹細胞的獲得，許多醫院會(hui) 對腫瘤樣品進行冷凍切片，而要從(cong) 解凍組織中獲得可用的細胞就沒有從(cong) 新鮮樣品中取樣那麽(me) 簡單了。另外一個(ge) 問題在於(yu) 根據細胞表麵標記分離高純度的細胞群。近期The Scientist雜誌找到了一些專(zhuan) 家，請教了他們(men) 在這些方麵的經驗。

通過流式細胞儀(yi) 分選幹細胞

斯坦福大學的幹細胞生物學與(yu) 再生醫學研究院主任Irving L. Weissma教授是世界*的生物醫藥科學家，免疫學、癌生物學、幹細胞、腫瘤免疫和細胞治療等領域的，美國國家科學院和國家醫科院兩(liang) 院院士，文理科學院院士。他曾在世界上zui早發現、分離和純化造血幹細胞，並成功用於(yu) 癌的細胞移植治療，被譽為(wei) “幹細胞科學的*"。

癌症幹細胞通常是通過細胞表麵的標記物進行識別，並利用熒光共軛的抗體(ti) 進行染色（現下設計出了靶向不同標記物的不同顏色熒光試劑），這樣流式細胞儀(yi) 就能從(cong) 懸浮液中檢測到這些熒光細胞。雖然目前許多染色指南采用的是單克隆抗體(ti) ，但是一些小心的研究人員還會(hui) 加上一個(ge) 封閉步驟，用以阻止抗體(ti) 識別出假陽性。

Weissma教授建議道，僅(jin) 僅(jin) 采用一種標記物分離AML幹細胞並不夠，這個(ge) 由正常造血幹細胞分化成AML癌細胞的過程我們(men) 了解的比較多了，因此應該進行特異性的標記進行分離。Weissma教授建議從(cong) AML幹細胞群中要分離出CD34+，CD38-，CD90+，和Lin-細胞群。

對於(yu) 實體(ti) 腫瘤，專(zhuan) 家則指出研究人員需要先對目標癌症的幹細胞文獻非常了解熟悉，雖然研究已經發現Lgr5 能標記結腸癌腫瘤幹細胞，但細胞表麵的Lgr5 表達一般較低，其它的標記，如EpCAM、CD44和CD166也已由多項實驗證實，可以用於(yu) 癌症幹細胞分離（PNAS, 104:10158-63, 2007; J Clin Pathol, 65:140-45, 2012; Oncol Lett, 7:1544-48, 2014）。

來自斯坦福大學的Michael Clarke是*從(cong) 實體(ti) 腫瘤中分離出癌症幹細胞的科學家，他警告說雖然細胞表麵的標記物可富集，但是這些標記物並不能確保分選出來的細胞就會(hui) 發展成一個(ge) 完整腫瘤——驗證癌症幹細胞的關(guan) 鍵一步。由於(yu) 實體(ti) 腫瘤的癌症幹細胞標記差異很大，因此研究人員需要通過移植實驗對單個(ge) 腫瘤的所有細胞類型進行檢測。

“對於(yu) 大多數人來說zui棘手的就是分選，"Dove說，“流式細胞儀(yi) 操作並不便宜，也不容易，研究人員如果沒有經驗就需要摸索各種閾值，校準和參數。而且更重要的是，利用抗體(ti) 分離癌症幹細胞會(hui) 由於(yu) 發射光譜重疊而造成紊亂(luan) ，研究人員應該仔細分析實驗中采用的每種單克隆抗體(ti) 的用量，比較不同的熒光基團抗體(ti) 組合效果，換句話說，這就是一個(ge) 費時費力的優(you) 化過程。

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