NF-κB在患者外周血核細胞TNFα和IL-6表達作用

 血液透析是慢性腎功能衰竭(CRF)的替代治療方法之一,營養(yang) 不良、動脈粥樣硬化、澱粉樣變、感染等是維持性血液透析(MHD)常見並發症,發生率高,是影響患者生活質量和存活率的重要因素.目前認為(wei) ,在透析相關(guan) 並發症的發生發展中,MHD患者外周血單個(ge) 核細胞(PBMC)中促炎症介質白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)等異常高表達起著關(guan) 鍵作用,降低其表達可降低血液透析相關(guan) 並發症的發生率,減輕其嚴(yan) 重程度,延緩其發展；核因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)是序列特異的轉錄因子,對IL-6、TNFα等促炎症介質基因和蛋白質的表達起關(guan) 鍵的調控作用.因此,研究MHD患者NF-κB信號途徑的活化狀態,及其在TNFα和IL-6表達中的作用將有助於(yu) 深入探討MHD患者血液透析相關(guan) 並發症的發病機製和探索有效的治療方法.
   為(wei) 此,本文將從(cong) 下列幾個(ge) 方麵對其進行研究:（1）觀察MHD患者透析前PBMCTNFα和IL-6表達水平及其對脂多糖(LPS)刺激的反應性；（2）觀察MHD患者透析前PBMC NF-κB活化水平,及其與(yu) TNFα和IL-6表達的關(guan) 係,觀察NF-κB特異性抑製劑吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)對PBMC NF-κB活化及TNFα、IL-6表達的影響,探討NF-κB在MHD患者PBMC TNFα和IL-6表達中的作用；（3）在單次血液透析中,觀察二醋酸纖維素膜（CDA膜）和聚碸膜（PS膜）MHD患者血液透析前後PBMC NF-κB活性水平的變化,及NF-κB信號途徑對透析4h後PBMC TNFα和IL-6表達的影響,探討不同透析膜對MHD患者PBMC NF-κB信號途徑活性的影響及意義(yi) .
   一、MHD患者透析前PBMC TNFα和IL-6表達水平的觀察
   研究對象為(wei) 使用同種膜材料透析器超過6個(ge) 月的MHD患者26例,其中CDA膜15例,PS膜11例,碳酸氫鹽透析,每次4h,每周3次,血流量200～280 ml/min,透析液流量500ml/min；健康誌願者10例,尚未行腎髒替代治療的CRF患者12例（非透析CRF組）.采外周血25mL,梯度密度離心法製備新鮮PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培養(yang) （5％〓、37℃）,培養(yang) 分組為(wei) :（1）LPS刺激組（LPS終濃度為(wei) 1mg/L,LPS組）；（2）單純含5％新生牛血清的RPMI1640培養(yang) 基（單純培養(yang) 組）.血漿和PBMC培養(yang) 上清液IL-6和TNFα采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定,培養(yang) PBMC IL-6和TNFαmRNA采用半定量逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測,血C-反應蛋白(CRP)水平采用免疫濁度法測定.結果顯示:（1）單純培養(yang) 基培養(yang) 下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC培養(yang) 上清液IL-6含量分別為(wei) 4.67、5.79、6.55和6.28(ng/mL),TNFα含量分別為(wei) 475.7、545.7、654.5和641.4(pg/mL),IL-6mRNA表達量分別為(wei) 0.12、0.21、0.35和0.33（吸光度A值）,TNFαmRNA表達量分別為(wei) 0.66、0.85、1.14和1.09（吸光度A值）,上述結果比較,PS膜組和CDA組MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質表達均高於(yu) 健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與(yu) CDA膜組間比較差異沒有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高於(yu) 健康人（P<0.05）.（2）LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC IL-6、TNFα蛋白質和mRNA表達均高於(yu) 單純培養(yang) 組（P<0.01）,且PS膜組和CDA膜組患者高於(yu) 健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與(yu) CDA膜組間差異沒有顯著性（P>0.05）.（3）健康人、非透析CRF、MHD患者血漿IL-6濃度分別為(wei) 16.7、26.2、25.6和26.8（pg/mL）,TNFα濃度分別為(wei) 42.9、56.3、58.6和54.1（pg/mL）,非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者血漿IL-6和TNFα濃度均高於(yu) 健康人（P<0.05）,它們(men) 三者間差異沒有顯著性（P>0.05）.（4）CDA膜和PS膜組患者血CRP水平高於(yu) 健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜與(yu) CDA膜組間差異沒有顯著性（P>0.05）；CDA膜和PS膜組患者血漿白蛋白水平低於(yu) 健康人（P<0.05）.（5）相關(guan) 分析顯示,MHD患者PBMC TNFαmRNA和蛋白質表達與(yu) 血CRP水平呈正相關(guan) （r=0.61和r=0.68,P<0.05）,與(yu) 血漿白蛋白呈負相關(guan) （r=-0.57和r=-0.62,P<0.05）；IL-6 mRNA和蛋白質表達與(yu) 血CRP水平呈正相關(guan) (r=0.66和r=0.71,P<0.05）,與(yu) 血漿白蛋白呈負相關(guan) （r=-0.66和r=-0.53,P<0.05）.
   結果提示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質異常高表達,PBMC對LPS的反應性也明顯增高；MHD患者PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質異常高表達與(yu) 血CRP水平呈正相關(guan) ,與(yu) 血漿白蛋白呈負相關(guan) .
   二、MHD患者透析前PBMC NF-κB活性水平觀察及其對TNF-α和IL-6表達的影響
   研究對象同*部分.采外周血25mL,梯度密度離心法製備新鮮PBMC,5％新生牛血清RPMI1640培養(yang) 24h,分別加入:（1）終濃度為(wei) 1mg/L的LPS（LPS組）；（2）終濃度為(wei) 100pmol/mL的PDTC（PDTC組）；（3）先加入終濃度為(wei) 100pmol/mL的PDTC培養(yang) 10min,然後加入終濃度為(wei) 1mg/L的LPS（LPS+PDTC組）；（4）單純含5％新生牛血清的RPMI1640培養(yang) 基（單純培養(yang) 組）.RT-PCR法檢測PBMC IL-6和TNFα mRNA,ELISA法測定培養(yang) 上清液IL-6和TNFα,電泳遷移率改變實驗(EMSA)及圖象分析技術測定NF-κB活性.結果發現,（1）單純培養(yang) 基培養(yang) 下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC NF-κB活性分別為(wei) 0.30、0.53、0.77和0.74（吸光度A值）,CDA膜組和PS膜組MHD患者高於(yu) 健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,CDA膜組與(yu) PS膜組間差異沒有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高於(yu) 健康人（P<0.05）；LPS刺激下,健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者PBMC NF-κB活性分別為(wei) 1.17、1.95、2.24和2.17（吸光度A值）,均高於(yu) 單純培養(yang) 時（P<0.01）,且PS膜組和CDA膜組患者高於(yu) 健康人和非透析CRF患者（P<0.05）,PS膜組與(yu) CDA膜組間差異沒有顯著性（P>0.05）,非透析CRF患者高於(yu) 健康人（P<0.05）.（3）在健康人、非透析CRF、CDA膜和PS膜組患者,NF-κB特異性抑製劑PDTC顯著抑製單純培養(yang) 基培養(yang) 或LPS刺激的PBMC NF-κB活性（P<0.01）,同時,明顯抑製TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質的表達（P<0.01）.（4）MHD患者PBMC NF-κB活性與(yu) 血漿IL-6、TNFα水平呈正相關(guan) ,相關(guan) 係數分別為(wei) r=0.75和r=0.69（P<0.05）；與(yu) PBMC IL-6 mRNA和蛋白質表達呈正相關(guan) （r=0.65和r=0.85,P<0.05）,與(yu) PBMC TNFαmRNA和蛋白質表達也呈正相關(guan) （r=0.75和r=0.63,P<0.05）.
   上述結果提示,在單純培養(yang) 下,MHD患者透析前PBMC NF-κB信號途徑呈高度活化,且與(yu) IL-6、TNFαmRNA和蛋白質異常高表達呈正相關(guan) ；MHD患者PBMC NF-κB容易被LPS等刺激因素活化；PDTC可阻抑NF-κB活化,同時,顯著抑製MHD患者PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質的表達；我們(men) 認為(wei) ,NF-κB信號途徑可能在MHD患者透析前PBMC IL-6和TNFα異常高表達中起重要作用.
   三、NF-κB對血液透析中PBMC TNFα和IL-6表達的影響
   研究對象、材料和方法同第二部分.結果發現:（1）血液透析4h後,CDA膜組患者PBMC NF-κB活性明顯高於(yu) 透析前（0.83 vs 0.77,A值,P<0.01）,培養(yang) 上清液IL-6含量明顯高於(yu) 透析前（7.03 vs 6.55ng/mL,P<0.05）,TNFα含量明顯高於(yu) 透析前（706.7 vs 654.5pg/mL,P<0.01）,IL-6 mRNA表達明顯高於(yu) 透析前（0.46vs 0.35,A值,P<0.01）,TNFαmRNA表達明顯高與(yu) 透析前（1.23 vs 1.14,A值,P<0.01）,PS膜組患者透析前後PBMC NF-κB活性分別為(wei) 0.74 vs 0.79（A值）,差異沒有顯著性（P>0.05）,透析前後IL-6 mRNA和蛋白質表達分別為(wei) 0.32 vs 0.36（A值）和6.28vs6.44（ng/mL）,差異沒有顯著性（P>0.05）,TNFαmRNA和蛋白質表達分別為(wei) 1.09vs 1.14（A值）和641.4 vs 661.5（pg/mL）,差異沒有顯著性（P>0.05）.（2）血液透析4h後,PDTC（100pmol/mL）對單純培養(yang) 和LPS刺激下的PBMC NF-κB活性均有明顯的抑製作用（P<0.01）,對PBMC IL-6、TNFα蛋白質和mRNA表達也有明顯抑製作用（P<0.01）.（3）單純培養(yang) 下,MHD患者透析4h後PBMC NF-κB活性與(yu) 培養(yang) 上清液IL-6和TNFα含量呈正相關(guan) ,相關(guan) 係數分別為(wei) 0.55和0.62（P<0.05）,與(yu) IL-6和TNFα mRNA表達量呈正相關(guan) ,相關(guan) 係數分別為(wei) 0.70和0.66（P<0.05）.
   以上結果提示,在單次血液透析中,CDA膜可引起MHD患者PBMC NF-κB活性水平增高,且後者與(yu) 透析4h後PBMC IL-6和TNFα表達增高密切相關(guan) ；PS膜活化NF-κB能力較弱；阻抑NF-κB信號途徑可下調透析4h後PBMC IL-6和TNFα的表達,提示NF-κB可能介導了單次血液透析中透析膜誘導的PBMC IL-6和TNFα的表達增高.
   總結
   本研究結果顯示,MHD患者透析前即存在PBMC TNFα、IL-6 mRNA和蛋白質異常高表達；PBMC NF-κB呈異常高活化,且與(yu) IL-6、TNFαmRNA和蛋白質異常高表達呈正相關(guan) ；PDTC可阻抑NF-κB活化,同時顯著抑製PBMC IL-6、TNFαmRNA和蛋白質的表達.在單次血液透析中,CDA膜血液透析可活化PBMCNF-κB,且後者與(yu) 透析後PBMC IL-6和TNFα表達增高密切相關(guan) ；阻抑NF-κB信號途徑可下調透析4h後PBMC IL-6和TNFα的表達.本研究結果初步顯示NF-κB信號途徑可能介導了MHD患者PBMC IL-6和TNFα的表達,為(wei) 探討MHD患者透析並發症的發病機製和探索治療方法提供新的思路和線索.