【ELISA實驗必看】ky体育在线登陆使用操作要點

酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高，特異性好，經濟安全等特點而在研究上廣泛應用，但是由於(yu) 其操作步驟複雜，一般包括試劑準備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結果判定等，其中任何一項操作不當都會(hui) 對檢測結果產(chan) 生很大影響。因此，必須加強ELISA檢測的全麵質量控製，保證其結果的準確可靠。

1 試劑

的試劑是保證檢驗質量的基礎。從(cong) 4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 後再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質分子的均勻分布。未用完的試劑和質控品應密封並及時放回冰箱保存。根據蛋白質在冷凍過程中出現蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配製的緩衝(chong) 液等，都必須調整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在製作過程中很難保證質量*一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，並保證保存條件，嚴(yan) 格執行這一標準可以避免試劑批號改變而重建質控體(ti) 係及重新評估試劑的複雜過程，並且能夠保證結果的穩定性。

2 標本

患者標本中有可能含有幹擾試驗的免疫物質，導致假陽性或假陰性的結果，幹擾因素一般可分為(wei) 兩(liang) 類，即內(nei) 源性和外源性幹擾因素。內(nei) 源性幹擾因素一般包括類風濕因子、補體(ti) 、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體(ti) 及某些自身抗體(ti) 等，避免內(nei) 源性幹擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性幹擾因素包括標本溶血、標本被細菌汙染、標本貯存時間過長及標本凝固等。要注意避免標本出現嚴(yan) 重溶血，標本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為(wei) 標記的ELISA測定試驗中，容易在溫育過程中吸附於(yu) 固相，從(cong) 而與(yu) 加入的底物反應顯色。標本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體(ti) ，在間接法ELISA測定中會(hui) 導致本底加深，甚至出現假陽性結果。通常血清標本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時間會(hui) 更長。血清標本應充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附於(yu) 微孔而造成假陽性結果。冷凍保存標本避免反複凍融，標本的反複凍融會(hui) 因其所產(chan) 生的機械剪切力對標本中的蛋白等分子產(chan) 生破壞作用，使抗體(ti) 效價(jia) 下降從(cong) 而引起假陰性結果。標本的采集及分離要注意盡量避免細菌的汙染。此外，標本在凍存時會(hui) 因蛋白質局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反複顛倒。

3 操作因素

3.1 加樣　

加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會(hui) 因機械磨損或推動杆內(nei) 附著的血痂等原因造成加樣不準，因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本均需更換吸嘴，以免發生交叉汙染；加樣速度不可太快，以免將標本加在孔壁上部，並注意不要濺出或產(chan) 生氣泡，加樣時還應注意操作時差對結果的影響，尤其對競爭(zheng) 法檢測結果影響更大。因此建議在加酶結合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應。稀釋的方式非常重要，*方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數抗原抗體(ti) 結合的zui適反應溫度。抗原抗體(ti) 反應一般在37℃經1～2 h 產(chan) 物的生成可達，為(wei) 加速反應，可在一定範圍內(nei) 提高反應的溫度並在反應過程中連續振蕩來增加抗原抗體(ti) 接觸的概率。抗原抗體(ti) 反應在4℃更為(wei) *，形成的產(chan) 物更多、更穩定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決(jue) 因受熱不均衡所致的周圍孔與(yu) 中央孔結果的吸光度差異（即“邊緣效應”）。可將ELISA板置於(yu) 水浴箱中，板底應貼著水麵，使溫度迅速平衡，為(wei) 避免蒸發，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內(nei) ，濕盒要選用傳(chuan) 熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，zui後將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應板不能重疊放置，防止溫度擴散的不均勻性。

3.3 洗滌　

洗滌是ELISA不同於(yu) 均相免疫學檢測技術的一大特征，洗滌在整個(ge) ELISA反應過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，卻非常關(guan) 鍵。其目的是去除反應體(ti) 係中與(yu) 反應無關(guan) 的成分，包括未結合的酶結合物以及反應過程中非特異性吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。洗滌液通常為(wei) 含有一定濃度Tween 20 的緩衝(chong) 液，Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親(qin) 水基團，又含疏水基團，在洗滌中的作用機製是借助其疏水基團與(yu) 經疏水性相互作用被動吸附於(yu) 聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團形成疏水鍵，從(cong) 而削弱蛋白分子與(yu) 固相的吸附。同時在其親(qin) 水基團與(yu) 液相中水分子的結合作用下，促進蛋白質分子脫離固相而進入液相，zui終被洗脫。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，zui常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為(wei) 中性的磷酸鹽緩衝(chong) 液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被於(yu) 固相上的抗原抗體(ti) 解吸附而影響實驗的測定下限。洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩(liang) 種方式，手工洗板則分為(wei) 浸泡式和流水衝(chong) 洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nei) 注液時應當避免氣泡殘留孔內(nei) ，否則會(hui) 因洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，要保證洗板機上的每個(ge) 吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液*吸淨，要求洗板後殘液小於(yu) 2 μL，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時間超過45 s。

3.4 顯色　

大多數情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為(wei) 過氧化氫，參加反應的顯色供氫體(ti) 有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯甲苯胺（OT）及四甲基聯苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶於(yu) 水，見光易變質，使用前配製，反應過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應產(chan) 物為(wei) 藍色，目視對比鮮明，其性質穩定，對人體(ti) 無毒。若選用各類酸性終止液，則會(hui) 使藍色轉變為(wei) 黃色。TMB作底物時的產(chan) 物檢測波長為(wei) 450 nm ，ALP 作為(wei) 標記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chan) 物為(wei) 黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為(wei) 了保證結果的穩定性，必須要嚴(yan) 格按照試劑盒說明書(shu) 中規定的溫度和時間操作，不可隨意改變溫度和時間。

3.5 比色　

ELISA 顯色結果必須通過酶標儀(yi) 進行檢測，不可由肉眼判斷結果，因為(wei) 不同個(ge) 體(ti) 的色覺存在差異，尤其是對於(yu) 乙型肝炎病毒e抗體(ti) 、乙型肝炎病毒核心抗體(ti) 這樣的檢測項目，肉眼難以判斷。酶標儀(yi) 應采用雙波長進行測定，包括對顏色產(chan) 物敏感和不敏感的2個(ge) 吸收峰波長，用非敏感波長清除由於(yu) 容器上的劃痕、指印、背景等造成的幹擾。TMBzui大吸收波長為(wei) 450 nm ，非敏感波長為(wei) 630 nm ，一般不設空白孔，否則會(hui) 出現吸光度值為(wei) 負值的現象。加入終止液後應盡快比色，否則樣本吸光度值會(hui) 逐漸下降，顯色越深下降越快，應在2 min 內(nei) 比色。

3.6 應加強檢測儀(yi) 器的質量控製　

如定量移液器要定期校準；洗板機要及時傾(qing) 倒廢液罐，補充洗滌液，開機後運行衝(chong) 洗程序（雙蒸水），檢查係統液路係統（有無漏水），檢查吸液和注液速度，關(guan) 機運行衝(chong) 洗程序（雙蒸水），清洗吸針及水箱，儀(yi) 器外觀清潔；酶標儀(yi) 要定期檢查濾光片是否合格，光源是否穩定，機械係統是否有故障，保持外觀清潔，並定期請廠家工程師進行保養(yang) 維修；水浴箱及存放試劑的冰箱要每天監測溫度，並有記錄等。

4 結果的判定與(yu) 報告

4.1 結果的判定　

嚴(yan) 格依據試劑盒提供的陽性判定值（CO）進行結果判定。廠商提供試劑的同時，說明書(shu) 上列出的CO值是建立在一係列科學試驗及統計研究的基礎上，不應隨意更改。定量測定需要製備標準曲線，根據標準曲線計算結果。

4.2 灰區的設置　

通常情況下ELISA結果報告方式為(wei) “陰性”或“陽性”，在二者之間有一條明確的分界線，也就是所謂的陽性判定值即CO值，對於(yu) 樣本的吸光度值（A）高於(yu) CO值就判斷為(wei) 陽性，相反則判斷為(wei) 陰性，然而在實際工作中經常會(hui) 出現樣本A 值位於(yu) CO 值附近的人群，即ELISA 檢測的“灰區”。在國內(nei) 的傳(chuan) 染性病原體(ti) 抗原和抗體(ti) 檢測的ELISA試劑盒中均未涉及到“灰區”的設置，僅(jin) 僅(jin) 依靠CO值來決(jue) 定感染的有無，尤其是對獻血員的篩查具有較大風險。筆者在實際工作中發現，結果處於(yu) CO值附近的患者重複性很差，也是容易引起醫療糾紛的人群。因此對於(yu) 檢測結果位於(yu) “灰區”的患者可采用確認試驗或追蹤檢測方法加以確診。

4.3 標本的複查　

ELISA 手工操作過程複雜，影響因素較多，即使室內(nei) 質控在控，也可能因孔間差異而造成結果差異，因此製定複查製度及加大複查力度可保證結果的準確性，比如對乙肝“兩(liang) 對半”處於(yu) “灰區”的標本及少見模式的檢測結果進行複查。本院在實際工作中嚴(yan) 格執行複查製度，取得了較好的效果。

5 質量控製

5.1 室內(nei) 質量控製（IQC） 　

要保證檢驗結果的準確可靠，必須做好IQC，首先要保證實驗室的環境、儀(yi) 器設備與(yu) 硬件設施必須處於(yu) 良好的狀態，其次要對試劑及測定方法過程進行理想化，另外實驗室技術人員必須經過良好的培訓。ELISA 定性試驗的研究意義(yi) 在於(yu) 是否檢出病原體(ti) ，與(yu) 檢出量無關(guan) 。因此質量控製要保證試驗的靈敏度，目前國內(nei) 實驗室定性試驗的質控規則還沒有統一的標準，較多單位采用“即刻法”，結合LeveyJennings 質控圖的方法。在每塊反應板中除了試劑盒附帶的陰陽性對照外，還要選擇至少2個(ge) 室內(nei) 質控品，其中一個(ge) 為(wei) 弱陽性的質控品接近CO值，S/CO值應該為(wei) 2～4之間，另一個(ge) 為(wei) 陰性質控品。認真分析每次IQC失控的原因，定期對各項檢測的均值、變異係數等進行比對分析，及時發現試劑盒檢出能力的變化，采取適當的措施來提高檢測的可靠性。

5.2 室間質量評價(jia) （EQA） 　

EQA 是一種回顧性評價(jia) ，主要是控製實驗室結果的準確性。其要點是保證同一患者的標本一樣對待室間質評物，必須強調的是EQA結果必須同IQC一並分析，找出原因，改進工作中的不足，同時指導實驗室選擇合適的試劑盒。

綜上所述，ELISA檢測操作步驟複雜，可能會(hui) 影響測定結果的因素較多，分布在測定操作的各個(ge) 步驟中，因此必須加強各環節的質量控製，才能得到準確可靠的檢測結果。

                                                                                                                引自《檢驗醫學與(yu) 研究》2009年7月