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ELISA的基礎是抗原或抗體(ti) 的固相化及抗原或抗體(ti) 的酶標記。結合在固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體(ti) 既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體(ti) 或抗原）與(yu) 固相載體(ti) 表麵的抗原或抗體(ti) 起反應。用洗滌的方法使固相載體(ti) 上形成的抗原抗體(ti) 複合物與(yu) 液體(ti) 中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體(ti) ，也通過反應而結合在固相載體(ti) 上。此時固相上的酶量與(yu) 標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為(wei) 有色產(chan) 物，產(chan) 物的量與(yu) 標本中受檢物質的量直接相關(guan) ，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於(yu) 酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

　　ELISA可用於(yu) 測定抗原，也可用於(yu) 測定抗體(ti) 。在這種測定方法中有三個(ge) 必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體(ti) ，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體(ti) ，稱為(wei) "結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體(ti) 條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於(yu) 研究檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

　　2.2.1　雙抗體(ti) 夾心法測抗原

　　雙抗體(ti) 夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

　　1） 將特異性抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 聯結，形成固相抗體(ti) 。洗滌除去未結合的抗體(ti) 及雜質。

　　2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與(yu) 固相抗體(ti) 結合，形成固相抗原抗體(ti) 複合物。　　洗滌除去其他未結合物質。

　　3） 加酶標抗體(ti) ，保溫反應。固相免疫複合物上的抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 結合。*洗滌未結合　　的酶標抗體(ti) 。此時固相載體(ti) 上帶有的酶量與(yu) 標本中受檢抗原的量相關(guan) 。

　　4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為(wei) 有色產(chan) 物。通過比色，測知標本中抗原的量。　　在研究檢驗中，此法適用於(yu) 檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。隻要獲得針對受檢抗原的異性抗體(ti) ，就可用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物而建立此法。如抗體(ti) 的來源為(wei) 抗血清，包被和酶標用的抗體(ti) 分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體(ti) ，一般選擇兩(liang) 個(ge) 針對抗原上不同決(jue) 定簇的單抗，分別用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體(ti) 一起保溫反應，作一步檢測。

　　在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成"夾心複合物"。類同於(yu) 沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於(yu) 抗原過剩帶上）與(yu) 標準曲線（位於(yu) 抗體(ti) 過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於(yu) 實際的含量，這種現象被稱為(wei) 鉤狀效應（hook effect），因為(wei) 標準曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴(yan) 重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測範圍的zui高值。用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) 製備此類試劑可削弱鉤狀效應。

　　假使在被測分子的不同位點上含有多個(ge) 相同的決(jue) 定簇，例如HBsAg的a決(jue) 定簇，也可用針對此決(jue) 定的同一單抗分別包被固相和製備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞(ya) 型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(ge) 亞(ya) 型，雖然每種亞(ya) 型均有相同的a決(jue) 定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

　　雙抗體(ti) 夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的幹擾。RF是一種自身抗體(ti) ，多為(wei) IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體(ti) 夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與(yu) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 結合，表現出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於(yu) 去除了Fc段，從(cong) 而消除RF的幹擾。雙抗體(ti) 夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為(wei) 這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。

　　雙抗體(ti) 夾心法適用於(yu) 測定二價(jia) 或二價(jia) 以上的大分子抗原，但不適用於(yu) 測定半抗原及小分子單價(jia) 抗原，因其不能形成兩(liang) 位點夾心。

　　2.2.2 雙抗原夾心法測抗體(ti)

　　反應模式與(yu) 雙抗體(ti) 夾心法類似。用特異性抗原進行包被和製備酶結合物，以檢測相應的抗體(ti) 。與(yu) 間接法測抗體(ti) 的不同之處為(wei) 以酶標抗原代替酶標抗抗體(ti) 。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於(yu) 測定，因此其敏感度相對高於(yu) 間接法。乙肝標誌物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關(guan) 鍵在於(yu) 酶標抗原的製備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

　　2.2.3 間接法測抗體(ti)

　　間接法是檢測抗體(ti) 常用的方法。其原理為(wei) 利用酶標記的抗抗體(ti) （抗人免疫球蛋白抗體(ti) ）以檢測與(yu) 固相抗原結合的受檢抗體(ti) ，故稱為(wei) 間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：

　　1）將特異性抗原與(yu) 固相載體(ti) 聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

　　2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體(ti) 與(yu) 固相抗原結合，形成固相抗原抗　　體(ti) 複合物。經洗滌後，固相載體(ti) 上隻留下特異性抗體(ti) ，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。

　　3）加酶標抗抗體(ti) 。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體(ti) ，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗　　體(ti) 。固相免疫複合物中的抗體(ti) 與(yu) 酶標抗體(ti) 抗體(ti) 結合，從(cong) 而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體(ti) 上的酶量與(yu) 標本中受檢抗體(ti) 的量正相關(guan) 。

　　4）加底物顯色

　　本法主要用於(yu) 對病原體(ti) 抗體(ti) 的檢測而進行傳(chuan) 染病的診斷。間接法的優(you) 點是隻要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體(ti) 建立檢測相應抗體(ti) 的方法。

　　間接法成功的關(guan) 鍵在於(yu) 抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與(yu) 一般健康科研血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為(wei) 工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與(yu) 受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體(ti) 發生反應。抗原中也不能含有與(yu) 酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體(ti) 組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關(guan) 蛋白，也會(hui) 因竟爭(zheng) 吸附而影響包被效果。

　　間接法中另一種幹擾因素為(wei) 正常血清中所含的高濃度的非特異性。病科研血清中受檢的特異性IgG隻占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體(ti) 上，有時也可吸附到包被抗原的表麵。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關(guan) 蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘(yu) 間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

　　2.2.4 競爭(zheng) 法測抗體(ti)

　　當抗原材料中的幹擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體(ti) 。其原理為(wei) 標本中的抗體(ti) 和一定量的酶標抗體(ti) 競爭(zheng) 與(yu) 固相抗原結合。標本中抗體(ti) 量越多，結合在固相上的酶標抗體(ti) 愈少，因此陽性反應呈色淺於(yu) 陰性反應。如抗原為(wei) 高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(hui) 有幹擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與(yu) 固相抗原相應的抗體(ti) ，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體(ti) 進行競爭(zheng) 結合反應。競爭(zheng) 法測抗體(ti) 有多種模式，可將標本和酶標抗體(ti) 與(yu) 固相抗原競爭(zheng) 結合，抗HBc 　　ELISA一般采用此法。另一種模式為(wei) 將標本與(yu) 抗原一起加入到固相抗體(ti) 中進行競爭(zheng) 結合，洗滌後再加入酶標抗體(ti) ，與(yu) 結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般采用此法。

　　2.2.5 競爭(zheng) 法測抗原

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩(liang) 個(ge) 以上的位點，因此不能用雙抗體(ti) 夾心法進行測定，可以采用競爭(zheng) 法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭(zheng) 與(yu) 固相抗體(ti) 結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，zui後的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

　　2.2.6 捕獲包被法測抗體(ti)

　　IgM抗體(ti) 的檢測用於(yu) 傳(chuan) 染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅(jin) 適用於(yu) 檢測總抗體(ti) 或IgG抗體(ti) 。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體(ti) ，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體(ti) ，後者將競爭(zheng) 結合固相抗原而使一部份IgM抗體(ti) 不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為(wei) 二抗，間接測定IgM抗體(ti) ，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體(ti) 處理，以除去IgG的幹擾。在研究檢驗中測定抗體(ti) IgM時多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體(ti) 包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體(ti) 和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅(jin) 與(yu) 特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體(ti) 。再與(yu) 底物作用，呈色即與(yu) 標本中的IgM成正相關(guan) 。此法常用於(yu) 病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體(ti) 的檢測模式見圖2-7。

　　類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體(ti) ，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體(ti) 已獲成功。

　　2.2.7 ABS-ELISA法

　　ABS為(wei) 親(qin) 和素(avidin)生物素(biotin)係統(system)的略語。親(qin) 和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個(ge) 分子由4個(ge) 能和生物素結合的亞(ya) 基組成。生物素為(wei) 小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀酰亞(ya) 胺酯可與(yu) 蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產(chan) 物，標記方法頗為(wei) 簡便。生物素與(yu) 親(qin) 和素的結合具有很強的特異性，其親(qin) 和力較抗原抗體(ti) 反應大得多，兩(liang) 者一經結合就極為(wei) 穩定。由於(yu) 一個(ge) 親(qin) 和素可與(yu) 4個(ge) 生物素分子結合，因此如把ABS與(yu) ELISA法可分為(wei) 酶標記親(qin) 和素-生物素（LAB）法和橋聯親(qin) 和素-生物素（ABC）法兩(liang) 種類型。兩(liang) 者均以生物素標記的抗體(ti) （或抗原）代替原ELISA係統中的酶標抗體(ti) （抗原）。在LAB中，固相生物素先與(yu) 不標記的親(qin) 和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親(qin) 和素從(cong) 蛋清中提取，這種卵親(qin) 和素為(wei) 堿性糖蛋白，與(yu) 聚苯乙烯載體(ti) 的吸附性很強，用於(yu) ELISA中可使本底增高。從(cong) 鏈黴菌中提取的鏈黴親(qin) 和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於(yu) ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩(liang) 種試劑，增加了操作步驟，在研究檢驗中ABS-ELISA應用不多。