人血管內皮生長因子（hVEGF165）融合蛋白的表達純化

    惡性腫瘤對人類的健康有極大的危害,其發病率呈逐年上升的趨勢。腫瘤的生長和轉移依賴於(yu) 新生血管的形成,血管內(nei) 皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在腫瘤新生血管形成中起關(guan) 鍵作用。

   因此抑製VEGF的信號轉導有可能抑製血管新生,並進一步抑製腫瘤生長。

   本實驗預構建可誘導的VEGF的原核表達體(ti) 係,以大量製備VEGF融合蛋白,為(wei) 下一步製備VEGF單克隆抗體(ti) ,及研究其抗腫瘤作用奠定了基礎。方法:根據VEGF165cDNA序列和原核表達載體(ti) pET-15b多克隆位點序列的特點,設計引物。以大腸癌組織總RNA為(wei) 模板,通過RT-PCR擴增得到VEGF165全長片段(576bp)。將VEGF165目的基因片段的PCR產(chan) 物進行低熔點瓊脂糖凝膠電泳,采用小量膠回收試劑盒進行回收純化。將載體(ti) 質粒pET-15b轉化入感受態E.coli DH5α,采用堿裂解法小量抽提載體(ti) 質粒。以限製性內(nei) 切酶BamHI及NdeI對目的基因及載體(ti) 質粒進行雙酶切,酶切反應產(chan) 物分別行低熔點瓊脂糖凝膠電泳,回收純化VEGF165目的基因片段和pET-15b載體(ti) 片段。將VEGF165目的基因片段和pET-15b載體(ti) 片段在T4DNA連接酶的作用下連接,構建pET-15b/VEGF165重組表達質粒。用連接反應液轉化感受態E.coli DH5α,轉化後進行氨苄青黴素篩選,陽性克隆菌落即為(wei) 含有重組表達質粒的重組工程菌。對重組工程菌進行小量培養(yang) ,小量抽提重組表達質粒,用BamHI及NdeI進行雙酶切鑒定和測序鑒定,以檢查重組表達質粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列是否發生改變以及閱讀框架是否正確。鑒定正確的重組表達質粒轉化表達型宿主菌BL21 (DE3),篩選後即得到VEGF165特異表達工程菌。挑取工程菌的單克隆菌落,接種於(yu) 含氨苄青黴素的LB培養(yang) 基中,37℃振蕩培養(yang) 至菌液OD600=0.4~0.6,加入PITG誘導培養(yang) 1~8h,收集菌體(ti) ,加入2×SDS凝膠加樣緩衝(chong) 液,超聲破菌,對誘導表達產(chan) 物分別進行SDS-PAGE和Weestn blot分析。確定表達後對誘導條件進行優(you) 化,並確定融合蛋白表達部位。其後大量誘導VEGF165融合蛋白表達,收集、洗滌包涵體(ti) ,以8mol/L尿素溶解後複性,將複性液經過HisPrep FF 16/10親(qin) 和層析柱以親(qin) 和層析的方法獲得純化的VEGF165融合蛋白。結果:重組表達質粒pET-15b/VEGF165經特異的雙酶切鑒定結果提示,各酶切片段實際大小與(yu) 理論大小基本一致。測序結果也表明,重組表達質粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列*正確,閱讀框架無誤,重組表達質粒構建成功。表達工程菌誘導表達產(chan) 物的SDS-PAGE分析表明,誘導表達產(chan) 物中均有相應的VEGF165重組融合蛋白表達,其表達水平較高,並為(wei) 包涵體(ti) 表達。進一步的經Western blot鑒定結果顯示,VEGF165重組融合蛋白能與(yu) VEGF多克隆抗體(ti) 特異結合,確實為(wei) 我們(men) 要表達的目的蛋白。確定了zui適宜的表達條件為(wei) :0.5mmol/L IPTG,37℃,誘導時間4~5h。表達產(chan) 物經HisPrep FF 16/10親(qin) 和層析柱親(qin) 和層析可分離純化得VEGF165融合蛋白。

    結論:本實驗成功構建了VEGF165基因的原核表達載體(ti) ,克隆的VEGF165基因在E.coli BL-21(DE3)中得到了穩定表達,並分離純化得高純度的VEGF165重組融合蛋白。pET-15b/VEGF165原核表達載體(ti) 的構建和誘導表達及分離純化的成功,為(wei) 下一步大量製備VEGF165目的蛋白,研製VEGF單克隆抗體(ti) ,及研究其抗腫瘤作用奠定了基礎。