免疫學檢驗中的ky体育在线登陆技術應用

　20世紀中期，以放射免疫技術為(wei) 代表的標記免疫技術相繼問世，它將某種可微量或超微量測定的物質（如放射性核素、熒光素、酶、化學發光劑等）標記於(yu) 抗原（抗體(ti) ）上製成標記物，加入到抗原抗體(ti) 的反應體(ti) 係中與(yu) 相應的抗體(ti) （抗原）反應，以檢測標記物的有無及含量間接反映被測物的存在與(yu) 多少。這些將標記技術與(yu) 抗原抗體(ti) 反應結合起來的免疫學檢測技術以其敏感性高、準確性好、操作簡便、易於(yu) 商品化和自動化等特點逐漸替代了凝集、沉澱等經典的免疫學檢驗技術，不僅(jin) 用於(yu) 抗原、抗體(ti) 、補體(ti) 、免疫細胞、細胞因子等免疫相關(guan) 物質的檢測，也用於(yu) 酶、微量元素、激素、微量蛋白等體(ti) 液中各種微量物質的檢查，可以說一切具有抗原性或半抗原性的物質原則上均可利用現代免疫檢驗技術進行檢測，使免疫學檢驗滲透到醫學的各個(ge) 領域。

　　目前，免疫學檢驗中的標記技術主要包括酶免疫技術、熒光免疫技術、放射免疫技術、金免疫技術、化學發光免疫技術等。其中酶免疫技術是以酶標記的抗體(ti) （抗原）作為(wei) 主要試劑，將抗原抗體(ti) 反應的特異性和酶催化底物反應的性和專(zhuan) 一性結合起來的一種免疫檢測技術。作為(wei) 經典的三大標記技術之一，酶免疫技術在檢驗醫學中得到廣泛應用並不斷得到更新。

一、常用的酶及顯色底物

　　在酶免疫技術中用於(yu) 標記的酶應具有催化活性高、催化專(zhuan) 一性強；與(yu) 抗原抗體(ti) 偶聯後不影響抗原抗體(ti) 的免疫反應性和酶活性；催化的底物易於(yu) 配製、保存且催化底物產(chan) 生的信號產(chan) 物易於(yu) 觀察和檢測；對人無害且價(jia) 廉、易得等特點，目前常用的酶及底物見表1。

表1 常用酶及底物

二、標記物的製備

　　在酶免疫技術中製備標記物的抗原應純度高、抗原性完整；製備標記物的抗體(ti) 應特異性好、效價(jia) 高、親(qin) 和力強、比活性高、能批量生物試劑和易於(yu) 分離純化。

　　製備酶標記物的方法應符合簡單、產(chan) 量高；避免酶、抗體(ti) （抗原）、酶標記物各自形成聚合物；標記反應不影響酶的活性和抗原抗體(ti) 的免疫反應性等原則。標記物製備的方法基本屬於(yu) 兩(liang) 類：

（一） 交聯法

　　交聯法是以一可同時與(yu) 酶和抗體(ti) （抗原）結合的 交聯劑作為(wei) “橋”，分別連接酶與(yu) 抗體(ti) （抗原）的方法，此類方法中目前zui常用的是戊二醛交聯法，形成的結合物為(wei) ：酶-戊二醛-抗體(ti) （抗原）

（二） 直接法

　　直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團直接可與(yu) 抗體(ti) （抗原）結合形成標記物，如過碘酸鈉法。形成的結合物為(wei) ：酶-抗體(ti) （抗原）。

三、酶免疫技術類型

　　酶免疫技術按照抗原抗體(ti) 係統是定位於(yu) 組織細胞上還是存在於(yu) 液體(ti) 樣品中分為(wei) 酶免疫組化技術和酶免疫測定（EIA），酶免疫測定又可分為(wei) 均相酶免疫測定和異相酶免疫測定。

（一） 均相酶免疫測定

　　均相酶免疫測定是利用酶標記物結合成抗原抗體(ti) 複合物後，標記酶的活性就受到抑製，因而反應後不需分離結合的和遊離的酶標記物，直接測定係統中的總標記酶的活性的變化，即可確定結合的酶標記物的數量，從(cong) 而得到待測物的含量的一種技術。常用於(yu) 半抗原或小分子抗原如藥物、激素等的測定。常用的技術類型有：

1．酶免疫增強測定技術（EMIT）：酶免疫測定增強技術中酶活性的抑製是由於(yu) 標記抗原與(yu) 抗體(ti) 結合後空間位阻了酶與(yu) 底物結合的部位而造成的。反應模式常用競爭(zheng) 法，即當未標記抗原多，競爭(zheng) 性的與(yu) 抗體(ti) 結合多，則標記抗原與(yu) 抗體(ti) 結合少，酶的活性受到抑製少，酶活性高。因此，zui終測得的酶活性與(yu) 未標記物的含量呈正相關(guan) 。
 

2．克隆酶供體(ti) 免疫分析（CEDIA）：克隆酶供體(ti) 免疫分析中酶是以供體(ti) 和受體(ti) 兩(liang) 個(ge) 片段存在的，隻有兩(liang) 個(ge) 片段結合在一起形成全酶才能具有活性，當標記了供體(ti) 酶的抗原與(yu) 抗體(ti) 結合後就空間位阻了酶供體(ti) （ED）與(yu) 酶受體(ti) （EA）的結合，從(cong) 而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑製。在反應模式上同樣為(wei) 競爭(zheng) 性結合分析方法，zui終測得的酶活性與(yu) 未標記抗原的含量呈正相關(guan) 。
 

（一） 異相酶免疫測定

　　異相酶免疫測定與(yu) 均相酶免疫測定的zui大區別是抗原抗體(ti) 反應平衡後，在反應體(ti) 係中同時存在著遊離的和結合的兩(liang) 種酶標記物，兩(liang) 種標記物上的酶都具有酶活性，而隻有結合的酶標記物的形成與(yu) 含量才代表待測物的存在與(yu) 含量。因此，需將遊離的和結合的酶標記物分離，測定結合狀態的酶標物的活性推算待測物的含量。因分離遊離和結合的標記物的方法不同，異相酶免疫測定又分成液相酶免疫測定和固相酶免疫測定兩(liang) 類方法。液相酶免疫測定，由於(yu) 遊離的和結合的標記物都存在於(yu) 液相中，故需用分離劑將二者分開後才能測定結合狀態的酶標記物的活性。而固相酶免疫測定，是通過載體(ti) 將結合狀態的酶標記物吸附在固相支持物上，隻需洗滌就可將遊離的酶標記物去除。目前固相酶免疫測定以酶聯免疫吸附試驗（ELISA）為(wei) zui常用。

　　綜上所述酶免疫技術的類型可歸納為(wei) ：

一、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

（一） 基本原理

　　酶聯免疫吸附試驗的基本原理是將過量抗體(ti) （抗原）包被於(yu) 載體(ti) 上，通過抗原抗體(ti) 反應使酶標記抗體(ti) （抗原）也結合在載體(ti) 上，經洗滌去除遊離的酶標記抗體(ti) （抗原）後，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chan) 物確定待測物的存在與(yu) 含量的檢測技術。

（二） 技術類型

　　酶聯免疫吸附試驗的主要技術類型有雙抗體(ti) 夾心法、間接法、競爭(zheng) 法、捕獲法等。

1．各種技術類型的原理如下：雙抗體(ti) 夾心法用於(yu) 檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩(liang) 個(ge) 抗原決(jue) 定簇A和B分別與(yu) 固相載體(ti) 上的抗體(ti) A和酶標記抗體(ti) B結合，形成抗體(ti) A-待測抗原-酶標抗體(ti) B複合物，複合物的形成量與(yu) 待測抗原含量成正比，屬非競爭(zheng) 性反應類型。

　　間接法用於(yu) 測定抗體(ti) 。它的原理是將已知抗原連接在固相載體(ti) 上，待測抗體(ti) 與(yu) 抗原結合後再與(yu) 酶標二抗結合，形成抗原-待測抗體(ti) -酶標二抗的複合物，複合物的形成量與(yu) 待測抗體(ti) 量成正比，屬非競爭(zheng) 性反應類型。

　　競爭(zheng) 法既可用於(yu) 檢測抗原又可用於(yu) 檢測抗體(ti) 。它是用酶標抗原（抗體(ti) ）與(yu) 待測的非標記抗原（抗體(ti) ）競爭(zheng) 性的與(yu) 固相載體(ti) 上的*抗體(ti) （抗原）結合，待測抗原（抗體(ti) ）多，則形成非標記複合物多，酶標抗原與(yu) 抗體(ti) 結合就少，也就是酶標記複合物少，因此，顯色程度與(yu) 待測物含量成反比。

　　捕獲法用於(yu) 測定IgM類抗體(ti) 。固相載體(ti) 上連接的是IgM的二抗，先將標本中的IgM類抗體(ti) 捕獲，防止IgG類抗體(ti) 對IgM測定的幹擾，此步驟也是其稱為(wei) 捕獲法的原因所在，然後再加入特異抗原和酶標抗體(ti) ，形成抗體(ti) IgM-IgM-特異抗原-酶標抗體(ti) 的複合物，複合物含量與(yu) 待測IgM成正比，也屬非競爭(zheng) 性反應類型。

2.各種技術類型的主要區別：見表2 。

表2 ELISA常用技術類型比較

（三） 技術要求

1.常用的固相載體(ti) ：ELISA中zui常用的固相載體(ti) 用聚苯乙烯製備，可製成微量反應板、小試管和小株，現多用微量反應板，它吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、批間穩定性好、價(jia) 格低廉且易於(yu) 與(yu) 自動化儀(yi) 器配套。另外，聚乙烯、聚氯乙烯酰胺等塑料製品也有使用。除塑料外，還可使用膜載體(ti) （如硝酸纖維素膜）、磁化微顆粒等。

2．固相包被物的製備：固相包被物的製備方法可以是吸附或化學偶聯。用聚苯乙烯做載體(ti) 包被抗原（抗體(ti) ）常用吸附的方法。4℃放置一夜或37℃2～6h經清洗後即可應用。為(wei) 防止包被後載體(ti) 上留有未包被的空隙而導致本底過高，常用1％～5％牛血清白蛋白封閉空隙。

3．*工作濃度的選擇：在酶聯免疫吸附試驗中為(wei) 防止本底高和靈敏度低，需要對包被抗體(ti) （抗原）和酶標抗體(ti) （抗原或二抗）進行滴定和選擇*工作濃度。如夾心法*工作濃度的選擇是用棋盤滴定法同時選擇包被抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 的工作濃度。如表三所示包被抗體(ti) 選擇3個(ge) 濃度酶標抗體(ti) 也選擇3個(ge) 濃度分別與(yu) 包被抗體(ti) 的3個(ge) 濃度配伍，然後分別加入強陽性抗原、弱陽性抗原和陰性對照，得到27個(ge) A值，以強陽性抗原A值在0.8，陰性對照A值<0.1為(wei) *工作條件，按照表3的測定結果可知包被抗體(ti) 的*工作濃度是1mg/L，酶標抗體(ti) 的工作濃度是1：5,000。

表3 雙抗體(ti) 夾心法包被抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 工作濃度選擇的棋盤法

二、酶免疫技術的發展

　　酶免疫測定具有高度敏感性、特異性，而且它的試劑比較穩定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動化儀(yi) 器的應用，使其成為(wei) 一種適用於(yu) 各級檢驗部門的免疫標記技術。隨著檢驗醫學的不斷發展，酶免疫測定的方法、技術也得到發展和更新，斑點-ELISA、發光酶免疫測定、免疫印跡法、BAS-酶聯免疫吸附試驗等方法不斷得到應用。

（一）斑點-ELISA

　　斑點-ELISA的原理與(yu) ELISA的區別在於(yu) 用對蛋白質有*吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料製品作為(wei) 固相載體(ti) ，酶作用底物後在硝酸纖維素膜上形成有色沉澱而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6～8倍、可達ng水平，試劑用量小，不需其它設備條件。

（二）免疫印跡法

　　免疫印跡法是將電泳與(yu) ELISA結合起來的一種方法。它先經十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳將樣品進行分離，通過轉印將被分離的各區帶原位轉移到硝酸纖維素膜上，然後把印有蛋白質條帶的膜當成包被抗原的固相載體(ti) ，做酶免疫測定。所以它的方法分為(wei) 電泳、轉印、酶免疫測定三個(ge) 階段。免疫印跡法結合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用於(yu) 分析樣品組分的免疫學測定方法。

（三）發光酶免疫測定

　　發光酶免疫測定與(yu) 一般EIA的區別是酶所催化的底物是發光劑。產(chan) 物不是一般EIA的有色物質，而是發光產(chan) 物，所發出的光可用特定的儀(yi) 器測定。常用的酶是HRP和AP，HRP的發光底物有魯米諾及衍生物、對-羥基苯乙酸；AP的底物為(wei) 3-（2--螺旋金剛烷）-4-甲氧基-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基傘(san) 形酮磷酸鹽。

（四）BAS-酶聯免疫吸附試驗

　　BAS-酶聯免疫吸附試驗是將生物素-親(qin) 和素（BAS）放大係統與(yu) ELISA結合起來的一種技術。生物素（B）是一種小分子的生長因子，有兩(liang) 個(ge) 環狀結構，其中一個(ge) 可以和親(qin) 和素結合，另一個(ge) 可以和包括酶、抗原（抗體(ti) ）的多種物質結合。親(qin) 和素（A）又稱卵白素，有4個(ge) 亞(ya) 基，都可與(yu) 生物素穩定結合，此為(wei) 放大係統的關(guan) 鍵，即有1個(ge) 親(qin) 和素就能結合4個(ge) 生物素，親(qin) 和素也可被酶標記。

　　在BAS的應用中正是利用了生物素和親(qin) 和素的這些特點，設計了兩(liang) 類反應類型：一類是以遊離親(qin) 和素為(wei) “橋”，分別連接生物素化抗原抗體(ti) 反應係統和酶標生物素。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標記親(qin) 和素連接生物素化抗原抗體(ti) 反應係統，此種類型有BA法。以雙抗體(ti) 夾心法測抗原為(wei) 例，各種類型的反應式表示如下。

BAB法的反應式可表示為(wei) ：固相抗體(ti) ＋待測抗原＋抗體(ti) -生物素＋親(qin) 和素＋生物素-酶＋底物。

ABC法的反應式可表示為(wei) ：固相抗體(ti) ＋待測抗原＋抗體(ti) -生物素＋親(qin) 和素＋生物素-酶-底物。

BA法的反應式可表示為(wei) ：固相抗體(ti) ＋待測抗原＋抗體(ti) -生物素＋親(qin) 和素-酶＋底物。

這種通過BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體(ti) 上，使酶免疫技術檢測的靈敏度進一步得到提高。