上海信帆生物總結:關於ELISA試驗中細胞樣本的處理方法

ELISA試驗中,對於(yu) 細胞樣本的處理方法總結如下:

對於(yu) 培養(yang) 細胞樣品：

1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內(nei) 加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為(wei) 1mM。

2. 對於(yu) 貼壁細胞：去除培養(yang) 液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yang) 液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有幹擾，可以不洗）。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒後，細胞就會(hui) 被裂解。

對於(yu) 懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解後應沒有明顯的細胞沉澱。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬(wan) 細胞/管，然後再裂解。

3. 充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鍾，取上清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

裂解液用量說明：通常6孔板每孔細胞加入150微升裂解液已經足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200微升或250微升。

對於(yu) 組織樣品：

1. 把組織剪切成細小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鍾內(nei) 加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為(wei) 1mM。

3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。）

4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

5. 充分裂解後，10000-14000g離心3-5分鍾，取上清，即可進行後續的PAGE、Western和免疫沉澱等操作。

6. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切後直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然後同樣離心取上清，用於(yu) 後續實驗。直接裂解的優(you) 點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注：RIPA裂解液的裂解產(chan) 物中經常會(hui) 出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為(wei) 含有基因組DNA等的複合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用於(yu) 後續實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨後離心取上清用於(yu) 後續實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。

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