H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的如何製備及ELISA診斷方法的建立

研究采用高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為(wei) 免疫原，免疫8周齡BALB／C雌性小鼠，三次加強免疫後取脾細胞與(yu) SP2／0細胞融合，用血凝抑製試驗（HI）方法檢測篩選，陽性細胞克隆經有限稀釋法克隆培養(yang) ，zui後獲得兩(liang) 株H7亞(ya) 型HA特異性單抗6H4和7F6，亞(ya) 類分別為(wei) IgG2a、IgG2b，輕鏈都為(wei) k鏈，經檢測具有良好的特異性。采用純化的HPAIV A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為(wei) 免疫原，滅活後加入弗氏*佐劑和不*佐劑製成疫苗多次免疫山羊，獲得抗H7亞(ya) 型禽流感的高免羊血清。 用羊血清作為(wei) 捕獲抗體(ti) ，H7亞(ya) 型特異性單克隆抗體(ti) 為(wei) 檢測抗體(ti) ，建立了檢測H7亞(ya) 型高致病性禽流感病毒的雙抗體(ti) 夾心ELISA方法。通過對各步反應條件進行優(you) 化，獲得的*工作條件為(wei) ：羊血清1：1000倍稀釋，單抗1：40000稀釋，酶標抗體(ti) 為(wei) 1：5000倍稀釋，一抗反應時間1.5h，酶標抗體(ti) 作用時間1.5h。 用建立的抗原捕捉ELISA方法對已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽類病毒以及其他15個(ge) HA亞(ya) 型禽流感標準病毒株進行交叉反應性試驗，結果表明：建立的H7亞(ya) 型高致病性禽流感抗原捕捉ELISA方法和其他禽類病毒以及其他亞(ya) 型禽流感病毒均沒有明顯的交叉反應性，說明該方法對H7亞(ya) 型高致病性禽流感病毒具有很好的特異性。 與(yu) 血凝試驗（HA）和雞胚接種試驗相比，本實驗建立的抗原捕獲ELISA方法較HA敏感2倍以上，但不如雞胚接種試驗敏感。 利用優(you) 化的ELISA反應條件對人工感染的研究樣本進行檢測，通過對脾髒、腎髒、心髒、肺髒等多份陰陽性樣本的檢測zui終確定以心髒作為(wei) 研究檢測的靶器官，並將0.099（OD_（490nm））作為(wei) 髒器的陰陽性判定標準。 將試驗用的各種試劑及包被的反應板組裝成試劑盒，同時保存於(yu) 室溫、4℃和-20℃，定期進行檢測，結果表明：試劑盒在室溫保存時極不穩定，保存期限很短，4℃和-20℃條件下都可以保存3個(ge) 月以上。