蛋白質印跡技術30年“進化”史

在發明蛋白質印跡法（Western Blot）出現了30多年之後，這項技術仍然是獲取特定蛋白可靠鑒定的關(guan) 鍵。許多近期湧現的產(chan) 品利用各種方法來提高蛋白質印跡實驗的可重複性、敏感性、定量性以及速度。

有三個(ge) 人都被認為(wei) 發展了蛋白質的免疫印跡方法，但其中隻有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白質印跡法）”的命名者，他就是當時在西雅圖哈欽森癌症研究中心Bob Nowinski實驗室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年發明的一項技術，使用膠、尼龍膜和吸水紙去鑒定一個(ge) 複雜個(ge) 體(ti) 中特定的DNA序列）、Northern Blotting（隨後發明出的相似策略，用於(yu) 鑒定RNA）以及位於(yu) 西海岸（West Coast）的Nowinski實驗室三者之意。

Burnette的技術成果直到1981年才得以發表。他回想起來，當時審稿人“特別”反對使用“Western blotting”這一名稱。但盡管如此，這個(ge) 名稱還是沿襲了下來，而且蛋白質印跡技術也成為(wei) 了zui廣泛使用的免疫化學技術之一。

工作原理

蛋白質印跡法的*步涉及到用凝膠電泳（Gelelectrophoresis）按照大小分離蛋白質，然後通過將膜置於(yu) 膠上，將蛋白質轉移到膜上（通常是硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜），並在膜上加上若幹片吸水紙，然後將這套堆層放在緩衝(chong) 溶液中，這樣就能通過毛細管作用將蛋白質向上拉拽到膜上。這也就是所謂的濕法或槽式轉印法。

另外兩(liang) 項技術是幹法和半幹轉印法，這兩(liang) 種方法比傳(chuan) 統的濕轉印法更快也更規整，但是對於(yu) 高分子量蛋白質而言，效率更低。對於(yu) 半幹轉印方法來說，膜和膠放置在被緩衝(chong) 液浸泡過的濾紙層之間，將這些都夾在陰極和陽極之間，電流就能驅動蛋白質轉移到膜上。三種方法中，幹法轉印zui快，但轉印效率也zui低。

轉印結束後，膜被放在稀釋過的蛋白質溶液中用來封閉非特異性的蛋白質結合。然後將膜與(yu) 一抗進行孵育、洗脫，再與(yu) 標記了信號檢測探針的二抗進行孵育。

zui後一步是檢測，通常采用化學發光或者熒光方法。在化學發光檢測中，與(yu) 酶交聯的二抗能夠與(yu) 檢測抗原產(chan) 生光發生反應，可以被膠片或成像裝置捕獲。而在熒光檢測中，抗體(ti) 探針被熒光集團所標記。

熒光檢測方法的主要優(you) 勢在於(yu) ，它可以同時檢測多個(ge) 蛋白質，並且其信號更加一致。因此與(yu) 化學發光檢測相比，也更有利於(yu) 量化研究。

不少製造蛋白質印跡相關(guan) 設備、軟件和消耗品的公司正在努力推動其中一些或所有步驟的自動化，期望能夠將這一實驗變得更加簡單有效。同時在實驗中加入了一些驗證點，讓研究人員能夠隨時監測實驗進展，甚至重新打造整個(ge) 過程。科學家們(men) 尋求的是性、穩健性和策略化，從(cong) 而能夠幫助他們(men) 避免浪費寶貴的造價(jia) 高昂的抗體(ti) 。

加速免疫檢測過程

轉印、抗體(ti) 孵育、上樣和洗脫步驟占據了蛋白質印跡法實驗80%的時間，EMD Millipore公司“蛋白質印跡法解決(jue) 方案”產(chan) 品Michele Hatler這樣介紹。

這家總部位於(yu) 加州泰梅庫拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白質檢測係統加速了整個(ge) 過程，使用真空裝置通過膜推入試劑，而不僅(jin) 僅(jin) 依賴於(yu) 擴散作用。這樣就能將免疫檢測的時間從(cong) 4小時縮短到30分鍾，Hatler表示。她解釋說：“我們(men) 真正致力於(yu) 提高蛋白質印跡工作流程的效率。我們(men) 仍然是按照傳(chuan) 統的步驟走，隻是加了一個(ge) 真空裝置。”

Hatler指出，2.0版本是於(yu) 2012年9月推出的，相比之前的版本有幾個(ge) 方麵的優(you) 勢。它可以使用中等大小的凝膠（8.5×13.5厘米）和迷你凝膠（7.5×8.4厘米），之前則隻能用迷你凝膠。

“這一設備很便宜，操作也很簡便，但切實提高了實驗效率，節省了實驗時間。” Hatler說。

伯樂(le) 公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白質轉移係統是實驗台麵大小的儀(yi) 器，能夠提供快速而的轉印。得益於(yu) 新的轉印緩衝(chong) 液配方，特殊的過濾材料和增強的電流強度（由一個(ge) 集成電源調節），這一係統能夠在短至3分鍾的時間內(nei) 完成轉印，並且印跡結果能與(yu) 槽式轉移相媲美。傳(chuan) 統的半幹轉移係統需要15到60分鍾時間，而且通常無法提供高分子量蛋白質轉移的有力結果。

增加驗證點以緩解憂慮

蛋白質印跡法的高失敗率常常令人感到非常沮喪(sang) ，尤其是你需要若幹天來換取一個(ge) 結果。“這是一項非常不穩定的技術，”伯樂(le) 公司“蛋白質印跡組”市場Ryan Short說，“我們(men) 對用戶調查時發現，一半的用戶報告他們(men) 用此技術的失敗率至少是25%。”

Short還說：“幾乎沒有什麽(me) 機會(hui) 可以檢查實驗過程是否滿足期望。由此就產(chan) 生了焦慮。我們(men) 正在引入可視驗證點的概念來增加信心和確定性。”

這家公司的標準和Mini-PROTEAN免染色預製膠，利用其ChemiDoc MP膠成像係統，使得研究者可以快速觀測到他們(men) 的蛋白是否正確地載入到凝膠上，進而確證高質量的蛋白質轉移，便於(yu) 決(jue) 定是否應該轉向下一個(ge) 步流程或是重新開始。ChemiDoc MP係統是為(wei) 化學發光和多元熒光斑點成像技術所設計，能夠在個(ge) 人電腦上用ImageLab軟件來操作。

這些驗證點“真的很有用”，在實驗室使用該係統的加州大學戴維斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我們(men) 可以成像這些免染的凝膠，不用加入額外的染料，而且能夠快速判斷跑在膠上的樣品是否出現問題。我們(men) 還能在蛋白質轉膜之後再去對凝膠成像，如果其中任何一個(ge) 步驟出現問題，我們(men) 都可以在這一點上停止實驗進程。”

成像和軟件提高定量性

當許多科學家仍在使用膠片分析蛋白質印跡時，世麵上開始出現越來越多的寬範圍免膠片凝膠記錄成像係統，這些係統可以用來成像並分析化學發光的印跡、熒光的印跡斑點或者同時檢測這兩(liang) 種印跡。許多公司開始紛紛努力，爭(zheng) 相製造盡可能便捷的成像儀(yi) 及其分析軟件。很多公司提供了按鍵式成像捕捉係統，其大小可在實驗台上操作。

Syngene公司於(yu) 2012年4月推出了非常簡潔的一鍵操作係統PXi，分析化學發光和熒光印跡。該係統是基於(yu) 該公司的G:BOX成像係統，並配有GeneSys成像軟件。

2012年10月，賽默飛世爾公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像儀(yi) ，使用紫外和可見光透射法，專(zhuan) 業(ye) 的濾鏡和電荷耦合器件（CCD）攝影技術去捕獲和分析蛋白質印跡以及蛋白和核酸凝膠。

CCD照相機的靈敏度比X射線膠片高兩(liang) 倍，據該公司介紹，該儀(yi) 器的動態範圍高達10倍。用戶隻需簡單地按下觸摸屏上其中一個(ge) *預設按鈕，無需調焦或調節照相機的設置。用戶也可以設置定製曝光，並可同時設置多達5個(ge) 不同的曝光，或者使用預設的曝光參數。這台成像儀(yi) 占用的儀(yi) 器空間很小，可以在實驗台上使用。

Aplegen公司的Omega Lum G凝膠記錄係統也具有自動聚焦的特點，可以在實驗台上操作，並配備了一台整合的平板電腦。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像儀(yi) ，其特色在於(yu) 整合的電腦和觸摸屏，允許用戶調節曝光、光圈、放大縮小和焦距等參數，當用戶按下實時預覽（Live Preview）按鈕時，還能提供圖像實例。

LI-COR公司的紅外成像係統版本是Odyssey CLx，該版本具有超過6對數的動態範圍，而前一個(ge) 版本隻具有超過4對數的動態範圍。當對蛋白質印跡結果進行解析時，這一增大的範圍能消除飽和度，提供了更寬的線性範圍可以轉換為(wei) 定量數據。

“研究者在他們(men) 的印跡中不僅(jin) 不會(hui) 達到飽和，而且他們(men) 還可以將多重印跡結果放進成像儀(yi) 中，根本無須擔心為(wei) 這些印跡進行不同的設置調整。”位於(yu) 林肯市的Nebraska公司產(chan) 品市場Jeff Harford解釋說。

Rehana Leak是位於(yu) 匹茲(zi) 堡的美國迪尤肯大學（Duquesne University）的助理教授，她使用LI-COR的Odyssey CLx係統進行細胞如何適應低水平脅迫的研究。“Odyssey成像儀(yi) 的優(you) 勢在於(yu) 它是16位的成像儀(yi) ，並且具有700和800納米兩(liang) 個(ge) 紅外波長，一次能夠成像兩(liang) 個(ge) 斑點。” Leak說，“這意味著我們(men) 可以一起檢測磷酸化和全部構象的蛋白。”兩(liang) 個(ge) 蛋白亞(ya) 型通過其他方法很難進行同步區分，因為(wei) 它們(men) 的基團非常相似。

Leak指出，Odyssey成像儀(yi) 能夠可視化216個(ge) 紅外線信號暗影，與(yu) 之相比，X射線膠片隻能灰度的呈現150個(ge) 暗影。“這將從(cong) 150個(ge) 躍遷到65000個(ge) 紅外暗影，因此這種方法可以獲取更高的分辨率。”她接著說，“這是不同尋常的定量化。”

2012年12月，LI-COR公布了一套新的數字成像係統，即C-DiGit係統，能夠用於(yu) 化學發光印跡。該係統將於(yu) 2013年推出。“就像zui近這些年數碼照相機取代膠片相機一樣，我們(men) 認為(wei) C-DiGit係統必將替代膠片化學發光。” LI-COR資深科學家Jon Anderson說，“這項技術能提供膠片用戶所習(xi) 慣的所有靈敏度和圖像質量，同時顯著提升了數字圖像的質量。”

軟件始終保持直觀

傳(chuan) 統的軟件分析蛋白質印跡時需要用戶從(cong) 圖像向電子表格導出數據，而後續的均一化計算和分析都由手動完成。BioRad於(yu) 2012年9月發布的Image Lab 4.1軟件，針對看家蛋白或總上樣蛋白提供嵌入式、自動化的均一化。

“這是目前我在市麵上見到的的產(chan) 品之一。”Gomes說，他正在研究蛋白酶體(ti) 和肌鈣蛋白在心髒和骨骼肌組織中的作用。“的一點是，它是*免費的。”Image Lab 4.1軟件比他之前在實驗室用過的圖像分析軟件都要簡便，Gomes接著說，幾乎每個(ge) 人都能掌握。“這的確增強了我們(men) 定量蛋白質的方法。”

LI-COR公司也已經推出了新的成像軟件——Image Studio，能與(yu) 其Odyssey係統一起使用。用戶隻需選擇一個(ge) 檢測通道，然後按一個(ge) 按鈕就能獲得一張圖像。這個(ge) 軟件的新版本提供毫米間隔的分析，而不是厘米間隔的，同時又能夠執行*的自動和手動分析。

重新打造蛋白質印跡

除了對傳(chuan) 統的蛋白質印跡技術進行微調，ProteinSimple公司的Simple Western係統對其進行了重新開發，用毛細管電泳使整個(ge) 過程*自動化。在2011年，該公司推出了Simon，計劃使用該儀(yi) 器全麵取代蛋白質印跡法。Simon能夠基於(yu) 大小進行分離、免疫檢測、洗滌、化學發光檢測和定量分析。科學家們(men) 僅(jin) 需要加上樣品，然後離開，稍後回來就能得到*分析好的數據。Simon甚至能夠發出蜂鳴聲告知用戶結果出來了。

該公司緊接著在2012年初推出了Sally，該儀(yi) 器允許用戶在一次實驗中進行96個(ge) Simple Western。而的設備則是2012年9月推出的Peggy，能夠一次分析96個(ge) 樣品，並能按照尺寸或電荷分離蛋白。Simple Western克服了傳(chuan) 統蛋白質印跡法中手動部分的缺陷，比方說缺少重複性或定量化結果。此外，在傳(chuan) 統蛋白質印跡法中，多重檢測已經成為(wei) 一種挑戰。研究者現在可以利用熒光去觀測一個(ge) 樣品中的2個(ge) 或3個(ge) 蛋白質，轉移的設備可以一次同時跑8塊迷你膠或4塊中等大小的膠，但這已經是傳(chuan) 統蛋白質印跡法所能達到的極限。Simple Western能夠在每個(ge) 毛細管中多重分析蛋白質，從(cong) 而在本質上消除傳(chuan) 統蛋白質印跡法的限製。

對於(yu) 斯坦福大學醫學院的腫瘤學教師Alice Fan來說，Simple Western技術zui令人興(xing) 奮的事情在於(yu) 它分析顯微級別樣品的能力。

Fan收集樣本組織樣本的時間已經超過10年，她一直在等待那個(ge) 能夠讓她分析腫瘤細胞蛋白質組的工具，而且還無需用去整個(ge) 樣品。“我找尋了多年，希望有一個(ge) 設備能夠用極少量的組織進行蛋白質印跡。”她解釋說。

除了幫助她保存之前儲(chu) 存的組織之外，Sally還讓Fan可以使用細針穿刺法多次從(cong) 樣本身體(ti) 中提取一些樣本，而不是做全麵的活體(ti) 檢視。Fan希望，這將能夠幫助她實時觀測樣本的腫瘤對藥物產(chan) 生的反應。“在描述不同類型的腫瘤方麵，這真的對我的研究大有裨益。這是巨大的進步。”

默克公司（Merck & Co）疫苗生物化學團隊負責人Richard Rustandi在2011年底購入了一台Simon儀(yi) 器。當時，他並沒有抱有很高的期待。但是，他說，他得到了意外的驚喜。“這台儀(yi) 器太棒了，我們(men) 在幾個(ge) 月後又買(mai) 了一台。”

據Rustandi介紹，盡管Simon並不是無瑕的，但它能夠真正實現定量化。他接著說，手動的蛋白質印跡法通常具有35%到45%的變異率，但他和他的實驗室能夠將Simon的變異率控製在10%以下。

隨著蛋白質印跡技術地不斷演化，研究者zui終不用像保姆一樣，花費大量的時間照看著他們(men) 的實驗。“他們(men) 的時間非常重要。” Simple Western的產(chan) 品Peter Fung認為(wei) ，“你的時間利用率越高，就越能做出好的研究。”