挑戰人類生殖: 用幹細胞製造胚胎

 自去年10月開始，分子生物學家Katsuhiko Hayashi就陸陸續續收到了許多夫妻的郵件，這些夫妻大多人到中年，仍然在為(wei) 了一件事情焦急：要一個(ge) 孩子。其中有一位英國的更年期婦女，希望到他位於(yu) 日本京都大學的實驗室，在他的幫助下懷上孩子，她寫(xie) 道：“這是我*的願望。”

這些請求開始於(yu) Hayashi一篇文章的發表——他原以為(wei) 隻有發育生物學家才會(hui) 對他的實驗結果感興(xing) 趣。在體(ti) 外條件下，利用小鼠的皮膚細胞創造可以發育成精子和卵子的原始生殖細胞（PGCs）。為(wei) 了證明這些實驗室培養(yang) 的原始生殖細胞與(yu) 自然發育而成的原始生殖細胞類似，他利用它們(men) 生成了卵子，進而創造小鼠生命。他表示，這個(ge) 創造出來的小鼠生命僅(jin) 僅(jin) 是他研究的一個(ge) “副產(chan) 品”，他的研究將意味著更多——利用不孕婦女的皮膚細胞為(wei) 她們(men) 提供可受精的卵細胞。與(yu) 此同時他還提出，男性的皮膚細胞也可以用來創造卵子，同樣，女性的皮膚細胞也可以生成精子。（事實上，研究結果發表後，許多同性戀發郵件給Hayashi ，索要更多的信息。）

盡管這是一項創新研究，但是公眾(zhong) 的廣泛關(guan) 注還是令Hayashi和他的教授Mitinori Saitou感到非常驚訝。他們(men) 花了十多年不斷挖掘哺乳動物配子產(chan) 生的微妙細節，然後在體(ti) 外條件下重新創建該過程——一切都是為(wei) 了科研，而非醫療。現在他們(men) 的方法使研究人員能夠創建無限的原始生殖細胞，這種在以前很難獲得的珍貴細胞的正常供應有助於(yu) 推動哺乳動物生殖研究。

但是，當他們(men) 將這個(ge) 科學挑戰自小鼠到猴子，再到人類推進時，這一過程被公眾(zhong) 定義(yi) 為(wei) 治療不孕不育的過程，於(yu) 是相關(guan) 的道德爭(zheng) 議隨之出現。“毫無疑問，他們(men) 在小鼠身上給這一領域帶來了重大的改變，” 洛杉磯加州大學的生育專(zhuan) 家Amander Clark說，“但是，在這項技術展示它的實用性之前，我們(men) 必須討論一下使用這種方式創造配子的倫(lun) 理問題。”

回到zui初

在小鼠體(ti) 內(nei) ，胚胎發育一周後，便出現約40個(ge) 左右的原始生殖細胞。這個(ge) 小小的細胞團進而在雌性小鼠體(ti) 內(nei) 形成成千上萬(wan) 的卵細胞，在雄性小鼠體(ti) 內(nei) 每天都能生成幾百萬(wan) 個(ge) 精細胞，並能夠遺傳(chuan) 小鼠的全套遺傳(chuan) 信息。Saitou想要了解在這些細胞發育過程中受到了那些信號的控製。

在過去的十年中，Saitou已經通過辛苦研究確定了幾個(ge) 基因——包括Sla, Blimp1 和Prdm14 ——這些基因的某種組合在某些時候對於(yu) PGCs的發育起到了至關(guan) 重要的作用。利用這些基因作為(wei) 標記，可以從(cong) 其他細胞中篩選原始生殖細胞以觀察這些細胞的變化。2009年，在日本神戶的RIKEN發育生物學中心，他發現，當培養(yang) 條件適當時，在的時間加入骨形態發生蛋白4（BMP4），可以胚胎幹細胞轉化為(wei) 原始生殖細胞的。為(wei) 了驗證這一發現，他向胚胎幹細胞提供高濃度的BMP4，結果顯示，幾乎所有的胚胎幹細胞都變成了PGCs。他和科學家們(men) 都預計這一過程非常複雜。

人造小鼠生殖細胞產(chan) 生小鼠胚胎的過程（點擊圖片查看大圖）

Saitou的方法嚴(yan) 格遵循了自然過程，這與(yu) 其他從(cong) 事類似研究的人形成了鮮明的對比，以色列魏茨曼科學研究所的幹細胞專(zhuan) 家Jacob Hanna說。許多科學家嚐試通過信號分子轟擊幹細胞在體(ti) 外創造特定類型的細胞，然後篩選細胞混合物得到他們(men) 想要的細胞。但是他們(men) 忽略了這些細胞的自然形成過程和這些人造細胞與(yu) 自然形成細胞的相似程度。Saitou找出了形成生殖細胞所需的條件，去除多餘(yu) 的信號幹擾並將每個(ge) 過程的時間控製，給他的同事們(men) 留下了深刻的印象。英國謝菲爾德大學的幹細胞生物學家Harry Moore將這種生殖細胞發育的重現視為(wei) 一場“勝利”。

到了2009年， Saitou在小鼠生殖細胞出現之前從(cong) 外胚層取了一些細胞，這成了研究的起點。但是想要真正掌握這個(ge) 過程中，Saitou希望從(cong) 細胞培養(yang) 開始。

當時正值Hayashi從(cong) 英國劍橋大學回到日本，和Saitou一樣，Hayashi在該領域Azim Surani英國的實驗室裏完成了4年的研究。Surani盛讚這兩(liang) 位科學家說，他們(men) 的“氣質、風格和解決(jue) 問題的方法能夠相互補充”。 Saitou “處理事情時很有係統性、完成目標一心一意”，而Hayashi“工作時更有直覺、視角更廣闊、處理問題方法相對更加寬鬆”，他說。“他們(men) 確實形成了一個(ge) 非常強大的團隊。”

Hayashi加入了Saitou京都大學的團隊，他很快就發現，那裏不同於(yu) 劍橋。在京都大學，Hayashi用在理論討論上的時間比曾經少得多，而更多的時間都花在實驗上。他說“在日本，我們(men) 隻管‘做’，這有時是非常低效的，但有時又醞釀著巨大的成功”。

Hayashi同樣以外胚層細胞作為(wei) 起點，但與(yu) Saitou不同的是，他試圖培養(yang) 一個(ge) 能夠產(chan) 生原始生殖細胞的穩定細胞係。可惜這種方法沒有奏效。Hayashi借鑒其他研究結果——一個(ge) 關(guan) 鍵調控分子（activin A）和生長因子（bFGF）可以將培養(yang) 的早期胚胎幹細胞轉化成類似於(yu) 外胚層細胞的細胞類型。這引發了Hayashi將這兩(liang) 個(ge) 因素結合起來的想法，誘導胚胎幹細胞分化為(wei) 外胚層，然後采用Saitou之前的方法把這些細胞成為(wei) 的PGCs。通過這種新的方法，他zui終獲得了成功。

為(wei) 了證明這些人造的原始生殖細胞是真實的拷貝，他們(men) 必須證明這些細胞可以進一步發育成精子和卵子。這一進程是非常複雜和難以理解的。所以研究小組將這一工作留給了自然——Hayashi將PGCs植入無法產(chan) 生精子的小鼠的睾丸，觀察這些細胞是否會(hui) 發育。Saitou認為(wei) ，這是可行的，但還是感到有些擔憂。當實驗進行到第3或4隻小鼠時，他們(men) 發現小鼠的輸精管裏充滿了精子。“這一切都發生得恰如其分，我知道他們(men) 會(hui) 產(chan) 生幼仔，”Hayashi說。研究小組將這些精子注入卵細胞中並植入雌性小鼠的胚胎，結果產(chan) 生了大量的雌性和雄性後代。

他們(men) 利用誘導多能幹細胞（iPS）進行反複的實驗，成熟的細胞被重新編程為(wei) 胚胎狀態。此外，精子被用於(yu) 生物試劑幼仔，證明它們(men) 具有基本功能——這是幹細胞分化領域的罕見成就。Clark說：“這是整個(ge) 多能性幹細胞研究領域裏在培養(yang) 皿中生成全功能細胞類型少有的成功案例之一。”

他們(men) 預計形成卵細胞更複雜，但是在去年，Hayashi在體(ti) 外條件下製作有正常著色的原始生殖細胞並轉入白化小鼠的卵巢，將產(chan) 生的卵細胞體(ti) 外受精後植入代孕。當透過幼崽半透明的眼瞼看到黑色的眼睛時，他知道這一切又成功了。

生殖細胞的回饋

目前，許多研究人員已經能夠複製驗室培養(yang) 原始生殖細胞的過程。人造原始生殖細胞特定用於(yu) 表觀遺傳(chuan) 學研究：通過修飾DNA確定哪些基因表達。zui常見的修飾就是為(wei) DNA堿基加上甲基，這些修飾在有些情況下，能夠反映生物所經曆的曆史過程。與(yu) 其它類型的細胞類似，表觀遺傳(chuan) 標記改變了原始生殖細胞在胚胎發育過程中的命運，但原始生殖細胞有個(ge) 與(yu) 眾(zhong) 不同的特點，就是當它們(men) 發育成精子和卵子後，表觀遺傳(chuan) 標記被擦除。這就允許細胞創建能夠形成任何類型細胞的受精卵。

表觀遺傳(chuan) 微妙變化中出現錯誤將會(hui) 導致不孕不育並出現器官故障，如如睾丸癌。Surani和Hanna的團隊已經利用人造原始生殖細胞研究不同酶在表觀遺傳(chuan) 調控中的作用，也許有一天，能夠解答表觀遺傳(chuan) 網絡如何參與(yu) 疾病調控。

事實上，體(ti) 外產(chan) 生的原始生殖細胞可以為(wei) 研究提供數百萬(wan) 個(ge) 細胞，而不是供科學家研究了40個(ge) 左右，這些細胞可以通過解剖早期胚胎獲得。Hanna說：“這是一個(ge) 大問題，因為(wei) 我們(men) 這裏有這些稀有的原始生殖細胞正在經曆我們(men) 尚不了解的全基因組表觀遺傳(chuan) 變化。”“體(ti) 外模型為(wei) 科學家們(men) 提供了的方便，” Clark表示認同。

研究意義(yi)

但是Hayashi和Saitou沒有辦法向乞求幫助的不孕夫妻提供幫助。在這種方法被運用在研究之前，還有許多問題需要梳理。

Saitou和Hayashi發現，雖然運用他們(men) 的技術所產(chan) 生的後代通常似乎是健康和大量的，但這些後代產(chan) 生的原始生殖細胞並生不*“正常”。 第二代原始生殖細胞產(chan) 生的卵細胞往往是脆弱、畸形的，並且從(cong) 支持它們(men) 生長的組織上脫離。當受精時，卵細胞內(nei) 部會(hui) 分為(wei) 三組染色體(ti) ，而不是正常的兩(liang) 組，體(ti) 外受精的成功率也隻有正常原始生殖細胞的三分之一。哈佛醫學院從(cong) 事表觀遺傳(chuan) 學研究的Yi Zhang，使用Saitou的方法在研究中發現，體(ti) 外受精過程中，人造的原始生殖細胞不能像自然狀態下產(chan) 生的原始生殖細胞一樣，抹去它們(men) 的表觀遺傳(chuan) 標記。“我們(men) 必須要知道，這些都是PGCs的類似細胞，而不是真正的原始生殖細胞，”他說。

此外，這項技術還存在兩(liang) 個(ge) 大的挑戰。首先是在不將PGCs放回睾丸或卵巢的前提下買(mai) 入和使它們(men) 變成成熟的精子和卵子，Hayashi目前正在試圖破解PGCs生成卵子或精子的生物信號，使人工培育條件下完成這一階段成為(wei) 可能。

但zui可怕的挑戰是在人體(ti) 重複上述所有的工作。該小組已經在利用Saitou找到的關(guan) 鍵調控基因來調整人類的iPS細胞，但是Saitou 和Hayashi都知道，人類的信息調控網絡不同於(yu) 小鼠。此外，Saitou有無數的小鼠胚胎進行解剖，但無法在人類胚胎進行相應的實驗步驟。幸運的是，他們(men) 得到了長達5年共1.2億(yi) 日元的資助，每周可以獲得20個(ge) 猴子胚胎。Hayashi表示如果一切順利的話，他們(men) 可以在5-10年內(nei) 在猴子身上完成所有的工作。隨後經過一些小的調整，這種方法就可以用來生物試劑人類原始生殖細胞。

但是利用原始生殖細胞治療人類不孕不育仍將是一個(ge) 巨大的跳躍，許多科學家對此持有相當謹慎的態度，這當然包括Saitou在內(nei) 。iPS和胚胎幹細胞在培養(yang) 過程中常常會(hui) 出現染色體(ti) 異常、基因突變等現象。“如果在整個(ge) 過程中出現一點差錯，都可能產(chan) 生深遠的、多代的不良後果。” Moore說。

證明該技術在猴子實驗中時安全的，將打消人們(men) 的顧慮。但又有新的問題隨之而來，要有多少健康的猴子出生，才能證明這個(ge) 方法是安全的？實驗需要觀察多少個(ge) 猴子世代？

zui終，還是需要人類胚胎進行測試，而這一進程勢必會(hui) 受到胚胎研究倫(lun) 理問題的限製。近年來，新的非侵入性成像技術，將幫助醫生對胚胎質量的好壞進行排序。這種人造胚胎可以利用類似於(yu) 正常的體(ti) 外受精胚胎的植入方式進入母體(ti) 。這些有可能在胚胎研究態度較為(wei) 寬泛的地區實現。

當技術準備完成，挑戰生殖的更大壯舉(ju) 也是有可能實現的。舉(ju) 例來說，人的皮膚細胞理論上可以被用來創造與(yu) 伴侶(lv) 精子配對的卵細胞，然後植入子宮孕育。但是存在這樣的懷疑，有些事情似乎永遠無法實現——科學家協會(hui) 的Hinxton團隊認為(wei) 從(cong) 男性XY細胞很難獲得卵細胞，同理，女性的XX細胞，也很難培養(yang) 成為(wei) 精子。

Saitou用雄性小鼠iPS細胞製造出了精子，利用雌性小鼠製造出了卵細胞，他曾表示反過來也是可能的。如果是這樣的話，同一隻小鼠產(chan) 生的卵細胞和精子受精，就會(hui) 產(chan) 生，以前從(cong) 未見過的東(dong) 西：自交小鼠。Hayashi和Saitou都不願意嚐試這個(ge) 。“如果有充分的科研理由，我們(men) 隻會(hui) 在小鼠身上這麽(me) 做，”Saitou說。但眼下，他還沒有看到這樣的理由。

這兩(liang) 位科學家已經感受到樣本和資金的壓力，這項技術可能是無法做試管嬰兒(er) 的婦女或者是無法產(chan) 生精子或卵子的人的zui後希望。Hayashi表示真正可行的不孕不育治療方案可能要在10年甚至50年的未來方能實現。“在我看來，那是很遙遠的事，我不想給人們(men) 不現實的希望，”他說。

許多不孕不育患者隻看到了zui終的結果——小鼠實驗的成功——但卻忽略了多年艱苦細致的工作。Hayashi說，他們(men) 沒有意識到，人類胚胎與(yu) 小鼠差異非常之大，從(cong) 小鼠到人類就意味著這一切幾乎是從(cong) 零開始。（轉自 生物探索）