ELISA檢測技術對於BT抗蟲基因植物的研究

     農(nong) 業(ye) 是國家的基礎。農(nong) 業(ye) 當中不可避免的就是蟲害的問題。接下來，我們(men) 就討論一下ky体育在线登陆檢測技術對抗蟲基因植物的研究。
    眼下應用得和zui有潛力的一個(ge) 抗蟲基因是Bt殺蟲基因，在農(nong) 業(ye) 蟲害的防治過程中起到非常重要的作用。雖然現在獲得的轉Bt抗蟲基因植物已達近70種，但是新的Bt殺蟲基因仍然不斷的被分離和鑒定，使得轉Bt抗蟲基因植物的研究持續、高速發展，因此急需找到一種快速、簡便、準確的檢測方法。

    此ELISA研究實驗以目前抗蟲轉基因育種中研究zui多的Bt CryIA（C）基因的表達產(chan) 物為(wei) 檢測目標，在提取出高純度抗原並製備出高特異性抗體(ti) 的基礎上，係統研究了兩(liang) 種載體(ti) 上三種ky体育在线登陆測定方法的檢測靈敏度，初步建立起快速、準確的ELISA檢測技術。研究結果如下：

 一．采用多種生化技術提取蘇雲(yun) 金芽孢杆菌的殺蟲晶體(ti) 蛋白，製備出了高純度的抗原。首先用堿液（50mM Na_2CO_3，50mM EDTA，3％巰基乙醇）裂解孢晶混合物，調節PH至等電點沉澱出晶體(ti) 殺蟲蛋白，再用聚丙烯酰胺凝膠製備電泳進一步純化粗提的殺蟲晶體(ti) 蛋白，經SDS-PAGE電泳分析顯示隻有一條帶，說明獲得的分子量約為(wei) 130KD的殺蟲晶體(ti) 蛋白達到了電泳純，為(wei) 製備特異性抗體(ti) 提供了條件保障。
 二．製備出了高特異性的Bt殺蟲蛋白抗體(ti) 和高質量的酶標抗體(ti) 。用純化的Bt殺蟲蛋白作為(wei) 抗原免疫白兔，獲得了高特異性的抗血清，再經過硫酸銨沉澱和DEAE-52柱層析純化，提取出了較純的IgG。采用改良的過碘酸鈉法，用辣根過氧化物酶標記IgG製備出了克分子比為(wei) 2、工作濃度為(wei) 1：800的高質量酶標抗體(ti) 。為(wei) 建立高靈敏度的酶聯免疫檢測方法奠定了基礎。

三．比較了兩(liang) 種載體(ti) 上三種ky体育在线登陆檢測方法的靈敏度，初步建立起檢測Bt殺蟲蛋白的高靈敏度方法。在聚苯乙烯酶標板上的測定結果表明：直接ELISA和夾心ELISA的靈敏度相同，都為(wei) 0.94ng／孔，但直接ELISA檢測中抗原濃度與(yu) OD值間的線性關(guan) 係呈極顯著，夾心ELISA中抗原濃度與(yu) OD值間的線性關(guan) 係呈顯著；間接ELISA的靈敏度較前兩(liang) 者低，使用HRP-IgG的靈敏度為(wei) 15ng／孔，抗原濃度與(yu) OD值間的線性關(guan) 係呈顯著，使用AKP-IgG的靈敏度為(wei) 3.75ng／孔，抗原濃度與(yu) OD值間的線性關(guan) 係呈極顯著。在硝酸纖維素膜上的測定結果表明：直接Dot—ELISA和夾心Dot-ELISA的靈敏度相同，都為(wei) 4.06-8.13ng，間接Dot-ELISA的靈敏度較前兩(liang) 者高，使用HRP-IgG的靈敏度為(wei) 2.03-4.06ng，使用AKP-IgG的靈敏度為(wei) 2.03ng。