一、 前 言
近二十幾年來，免疫學分析方法發展很快，特別是在使用標記了的抗原和抗體的分析技術以後，使原來許多經典的分析方法在敏感性和特異性方麵都不能相比。繼50年代的免疫熒光（IFA）和60年代的放射免疫（RIA）分析技術之後，在70年代初期又建立了用酶來標記抗原或抗體的分析技術。由於酶的生物催化作用，一個酶分子在數分鍾內可以催化幾十幾百個底物分子發生反應，產生了放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數分鍾後就可被識別出來，這種技術被稱為酶聯免疫吸附試驗法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相繼分別報道後，現已引起廣泛重視。
ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用於多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方麵的免疫診斷。也已應用於大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易於自動化操作等特點。不僅適用於研究標本的檢查，而且由於一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合於血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用於測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用範圍日益擴大，可概括四個方麵：
1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。
2、研究抗酶抗體的合成。
3、顯現微量的免疫沉澱反應。
4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。
二、方法的基本原理和種類
ELISA的基本原理有三條：
（1）抗原或抗體能以物理性地吸附於固相載體表麵，可能是蛋白和聚苯乙烯表麵間的疏水性部分相互吸附，並保持其免疫學活性；
（2）抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
（3）酶結合物與相應抗原或抗體結合後，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。
由於ELISA法一方麵是建立在抗原與抗體免疫學反應的基礎上，因而，具有特異性。而另一方麵又由於酶標記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結合物，它可以催化底物分子發生反應，產生放大作用，正因為此種放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一種既敏感又特異的方法。常用的ELISA有以下兩個方麵。
（一）測定抗原的，主要有四種方法。
1、競爭法（Competition method）:方法的基本原理可見圖1：本法首先將特異性抗體吸附於固相載體表麵，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表麵的這個過程，稱為包被（Coated），也可叫做致敏。經洗滌後分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組隻加酶標記抗原，再經孵育洗滌後加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測定的未知抗原的量。
這種方法所測定的抗原隻要有一個結合部位即可，因此，對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。該法的優點是快，因為隻有一個保溫洗滌過程。但需用較多量的酶標記抗原為其缺點。
圖1：竟爭法測抗原示意圖
2、雙抗體夾心法
方法的基本原理可用圖2來表示
圖2.雙抗體夾心法測抗原示意圖
本法首先也是用特異性抗體包被於固相載體，經洗滌後加入含有抗原之待測樣品，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被於固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌後，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌後，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結合的部位，因為其一端要包被於固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。因此，不能用於分子量小於5000的半抗原之類的抗原測定。我們用在霍亂腸毒素的測定。HbSAg及HbS的測定。
3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用於測定抗原的，其原理可用圖3來表示。
圖3.改良雙抗體夾心法測抗原示意圖
本法首先是將特異性抗體a包被於固相載體，經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌後再加一次未標記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b於*次包被於固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的，但不是用同種動物免疫製備的，否則可出現非特異性反應。經孵育洗滌後，再加酶標記抗b抗體，再經孵育洗滌後加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時避免標記特異性抗體，而另一優點是隻要標記一種抗抗體，即可達到多種應用。
用於測定抗原的尚有第4種叫做抑製性測定法（見圖4），它是先用抗原包被固相載體，然後分為二組，一組加入用參考抗體和被檢標本混合孵育後的混合溶液，假如標本中不含抗原，則參考抗體未被結合。因此它可以和包被於固相載體上的抗原結合。如標本中含有抗原，則抗原先與參考抗體結合，故參考抗體不再與包被於固相載體上的抗原結合。對加入酶結合物（抗球蛋白）和底物僅顯示剩餘結合的抗體量。再與另一組不加待檢標本的參考係統比較，被檢標本對底物顯色的抑製程度與標本中所含抗原量成比例，二者之差，即為欲測抗原的量。
圖4.抑製性測定法的原理
被檢標本對底物顯色的抑製程度與標本中所含抗原的量成比例，二者之差即為欲測抗原的量。
（二）測定抗體方麵：所用的方法稱為間接法，也是目前zui常用的方法，其原理可用圖5來表示。
圖5.間接法測抗體示意圖
間接法首先用抗原包被於固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經洗滌，加入含有被測抗體之標本，再經孵育洗滌後，加入酶標記抗抗體，（對人的標本來說即加酶標抗人球蛋白IgG、IgM），再經孵育洗滌後，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測抗體的量，其結果可用目測或用分光光度計定量測定，本法用不同種抗原包被固相載體後，隻要用一種酶標記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲病以及其他疾病的血清學診斷。如用酶標記抗人IgM,則可用於早期診斷。
三、ELISA的影響因素
這是ELISA檢測中的重要部分，可從9個方麵加以說明。
（一）固相載體：可溶性抗原或抗體吸附於固相載體而成為不溶形式，這是進行酶標記測定的基本條件。許多物質可作為固相載體，如纖維素、交聯右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中zui常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應板及塑料管。由於微量反應板所用試劑量少，操作方便，適合於大規模應用。國產聚苯乙烯微量反應板（上海塑料三廠出品）目前已大量應用於ELISA測定，並且獲得了滿意的結果。但每批微量反應板對抗原或抗體蛋白質的吸附性能是有顯著差別的。實驗證明，吸附效果似乎與塑料的類型及其表麵性質有關。特別是塑料製品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至*喪失吸附能力。因此，對每批製品在使用前，必須經過實驗室鑒定，鑒定的方法和標準是對每批購置的微量反應板或塑料管抽樣，用0.2ug/ml純化的正常人IgG進行包被，經洗滌後加酶標記抗人球蛋白進行反應，再經孵育洗滌，加底物顯色終止反應後，逐孔在酶標比色計中測定其消光值、光密度（O.D值）。一般認為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格，微量反應板或塑料管在使用前並不一定通過特殊處理。用蒸餾水衝洗即可應用。
（二）抗原：在ELISA中，包被於固相載體表麵的抗原或抗體的來源和製備方法對試驗結果都有影響。包被所用的抗原必須是可溶性的，而且要求是和穩定的製劑，純度和免疫原性要高。如果不純，由於抗原中所含雜質就會競爭固相載體上的有限位置，降低敏感性和特異性。此外還應考慮到製備包被抗原不應破壞其免疫學活性。經試驗證明，適用於其他血清學試驗的抗原並非均適合用於ELISA法。因此，對某一疾病的診斷，必須通過實踐，才能選出適用的抗原。對大多數傳染病和寄生蟲病的血清學診斷中所用的抗原並非要求十分嚴格，一般能用於補體結合試驗的可溶性抗原均可用於ELISA，例如超聲波抗原、凍融抗原、細菌的外膜抗原、脂多糖（LPS）、細菌的外毒素以及用表麵活性劑（如SDS）所提取的抗原等，在作ELISA時，必須要有1-2種試劑、要求純化，但用表麵活性劑提取的抗原在包被前必須透析除去表麵活性劑，否則就不易吸附到固相載體上去。此外，對某些抗原必須進行提純，如病毒的組織培養和雞胚培養物以及病毒接種動物的髒器等，它們當中存在著許多非抗原的蛋白質，必須設法除去，常用梯度超速離心或親和層析法提純，不經提純是不能使用的。在用特異性抗體包被固相載體時也要提純。用抗原或抗體蛋白包被固相載體時選擇的濃度要適當。如濃度太高，則低效價抗體可能測不出來，或包被過量形成多層抗原吸附，故在操作過程中可能脫落從而降低敏感性和可重複性。用zui適稀釋度抗原，包被固相載體不僅經濟，而且可以克服前帶現象。那麽用多大濃度抗原進行包被zui為合適呢？可通過棋盤滴定法進行測定，但用單項滴定法更為簡便，其方法是將抗原進行一係列稀釋包被微量反應板，再用一定稀釋度的陽性參考血清和陰性參考血清進行孵育後洗滌，再加酶結合物進行反應，經孵育洗滌後，加底物溶液顯色，終止反應後分別測定O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個抗原稀釋度為zui適包被濃度。一般總是要選擇那個O.D值稍大於1.0，而不選擇小於1.0的抗原濃度。陰性參考血清O.D值要求<0.1-0.2。也就是要求陽性參考血清和陰性參考血清的O.D值有明顯差別。抗原包被固相載體除濃度外，對時間、溫度、PH均有關係。溫度高（如37℃、45℃、或56℃），包被時間可縮短，溫度低可延長包被時間。但為了方便起見，通常采用4℃包被過夜，可使抗原吸附得更加*且均勻。在用聚苯乙烯或聚乙烯微量反應板或塑料管作固相載體時，在堿性條件下（如0.1mol/L、PH9.6碳酸鹽緩衝液稀釋抗原）4℃包被過夜較為合適。但在某些試驗中，如用LPS或毒素蛋白包被時，用
PH 7.2-7.4 PBS稀釋才是滿意的。包被特異蛋白質的濃度為1-10ug/ml，而對某些病原微生物抗原以5-20ug/ml較為合適，但均應通過滴定。
（三）試驗樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為ELISA的試驗樣品（標本）。但應注意分離血清時，血液要求放置室溫中凝固收縮，不宜置冰箱（4℃）中凝固，否則會使大部分IgM和少量IgG喪失活性。關於科研血清在保存過程中抗體的穩定性報導尚不多。但一般認為作ELISA血清要新鮮，若要貯藏，必須少量分裝保存於低溫冰箱，並防止反複凍融。血漿可用肝素毛細管法采血，而血清可用濾紙片法采血。
被檢血清或血漿標本，可用含保護性封阻劑（吐溫-20）或稱濕潤劑的緩衝液來稀釋。也可加入一些蛋白質，如1%牛血清白蛋白等來稀釋。然後再加到已經用抗原或抗體包被的固相載體中進行孵育。此種被試標本可作一係列稀釋度測定，也可用一個稀釋度測定。對於作某一個傳染病的診斷來說，先用一係列稀釋度作一批標本測定，求出對診斷有意義的一個稀釋度（即測定劑量反應曲線），然後用一個稀釋測定即可。zui適稀釋度和孵育時間均需從實踐中摸索出來，對一般病原微生物所引起的傳染病的血清學診斷，以1：200稀釋度測定比較適當，而試驗標本的（即含抗體）作用時間一般為室溫或37℃ 1-2小時。但現在對有些標本（如流腦抗原）測定時，僅用37℃ 5分鍾。對單克隆抗體檢測也可縮短作用時間。
（四）結合物：在ELISA中，用酶標記的抗體或抗原統稱為結合物，此為進行ELISA檢測的關鍵試劑。常規使用ELISA法的主要問題是能夠簡便地製備酶結合物，而此種製備好的酶結合物要求穩定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產量高及成本低。
用什麽樣的酶來標記抗原或抗體呢？可根據以下幾點來選擇適當的酶。
1、酶製品的純度及活力高，催化效力也高，放大倍數大（即一個酶分子能催化幾十幾百個底物分子發生反應的酶）。
2、酶及製備好的酶結合物在檢測或貯存中能保持穩定。
3、酶製劑易得、價廉.
4、既要適用於標記抗原，又適用於標記抗體，標記後不影響抗原或抗體的免疫學特性，也不降低酶的活性。
5、酶的反應產物穩定，檢測時簡便、快速。在定量測定中產物必須是可溶性的。
6、要有安全、價廉、易得的底物。
符合上述條件的酶有：堿性磷酸酶，一般用分子量為5×105（Alkaline Phospatase,簡稱AP），辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase,簡稱HRP,分子量為4×104）,另外尚有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰膽堿酯酶等等。其中以前兩種（AP和HRP）zui為常用。
AP活力高，製備好的酶結合物可加NaN3防腐，但此種酶不易獲得，因其是從小牛腸粘膜中或大腸杆菌中提取，而且價格比較昂貴。因此，目前國內外大多使用HRP。HRP活性也高，價格較便宜。但製得酶結合物不能加NaN3防腐。因NaN3能抑製HRP的活性，但可作低溫保存或加60%緩衝甘油等量混合後少量分裝，保存冰箱，一般可用1-2年。
由於HRPzui為常用，故先把HRP的一般性質介紹一下，以便在製備酶結合物時可引起注意。
（HRP的性質）:HRP係從辣根菜的根中所提取，這種酶是無色酶蛋白與暗棕色的鐵卟
NH2
啉（E鐵血素）相結合的一種醣蛋白，可簡寫成Fe-E ，由多個（6-7個）同功
CH2OH
酶所組成。分子量約為40000，等電點為PH7.2。能被58-62%飽和硫酸銨沉澱，在PH3.5-12均較穩定。63℃15分鍾，室溫數周、甲苯和其他苯類有機溶劑處理都不影響它的活性。
由於HRP中的酶蛋白和鐵卟啉分別在波長280nm和403nm有二個zui大吸收峰，其兩者的比值，即O.D403nm/O.D280nm稱為RZ值（係由德文Reinnoit-Zah）而來，表示酶的純度。高純度酶製品RZ值可達3.4。而RZ值0.6的酶其中非酶蛋白含量高達75%。不適合作ELISA用，經純化後才能應用。目前我們國產的HRP RZ值達2.5-3.0，亦可作ELISA用。
抗體：製備酶結合物的抗體要提純。被標記的抗體要求效價及親和力都要高，因為純化抗體可增加反應的特異性。如果采用級特異性的酶結合物（例如酶標抗IgM、酶標抗IgG）。有助於區別活動性感染（早期診斷）和已過性感染（追朔診斷）。但在大多數情況下，用抗血清中的蛋白成份與酶結合所製成的結合物亦可應用，而且相當穩定。其方法是用硫酸銨沉澱抗血清三次（50%飽和的1次，33%飽和的2次），經透析除鹽，即可用於標記。或者經DEAE-纖維素柱層析後所製成的IgG亦可標記。如將IgG再通過葡聚糖凝膠G-200膠濾（用PH7.2 PBS洗脫）所得純化IgG用HRP標記則更佳。但損失較大，也有人用親和層析法提純抗體來標記的。但在用酶來標記抗體前，需測定一下抗體球蛋白效價和蛋白含量。一般用Beutner氏瓊脂糖散法測效價（即玻片雙相瓊脂擴散法），中央孔加1mg/ml抗原，周圍孔加不同稀釋度粗製或提純抗體（馬或羊抗人IgG），室溫擴散24小時，沉澱反應效價達到1：16以上者即可應用。而蛋白質含量可用751紫外線分光光度計測定，也可用Folin酚法測定。
結合：用什麽樣的方法將HRP與抗體球蛋白結合起來呢？當然不能用強烈的方法，因為強烈的方法會使酶和抗體失去活性。故隻能用溫和的方法把酶和抗體結合起來。因此，必須使用結合劑。理想的結合劑應具備下列條件：（1）不影響酶及抗體活性，（2）不產生幹擾物質，（3）抗體和酶結合後應有較高的產量，（4）不出現非特異性反應,（5）結合程序簡便，（6）來源易、價廉。目前常用的有戊二醛和過碘酸鈉二種。由於對所使用結合劑的針對性，因此標記的方法也有戊二醛交聯法和過碘酸鈉氧化法兩類。
1、戊二醛交聯法：戊二醛是一種能使蛋白質與蛋白質聯結zui常用的雙功能試劑。它有2個對稱的活性醛基，可分別與酶蛋白和免疫球蛋白上的遊離氨基（酚基、味唑基、巰基）以共價鍵邊接起來而形成的酶結合物。例如酶（Fe-E-NH2CH2OH，）通過戊二醛與免疫球蛋白（Ig-NH2）的交聯反應式如下：
NH2 H H
Fe-E + OHC-（CH2）3-CHO + H2N-Ig--> Fe-E-N=C-（CH2）3-C=N-Ig+2H2O
CH2OH CH2OH
酶 低聚醣基團 戊二醛 免疫球蛋白 酶結合物 水
用戊二醛標記又可分為一步法和二步法。一步法主要是將酶、抗體球蛋白和戊二醛同時混合而直接製備。此法雖然簡單，但因酶蛋白的活性氨基少，免疫球蛋白的活性氨基多，在戊二醛作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物，當然也可形成酶蛋白的聚合物。因而，形成酶標記抗體的比例較少，同時抗體和酶的活性喪失較多，結合物的酶活性較低，但較簡便。戊二醛二步法中先用過量的戊二醛與酶作用，使戊二醛上的一個活性醛基先與酶蛋白上的一個氨基結合後，除去過量戊二醛（可通過葡聚糖凝膠G-25過柱或用透析法除去），然後，再加入抗體球蛋白，使之與酶--戊二醛複合物反應，形成酶結合物。而酶結合物的多餘醛基可用加入小分子的氨基酸如賴氨酸除去，於穩定酶結合物的特異性。在戊二醛二步法中，酶本身並不產生縮合，因為在第二步酶分子上的一個遊離氨基僅與戊二醛上的一個活性醛基聯結，而戊二醛上另一個活性醛基則可與第二步加入的抗體球蛋白分子上的氨基結合生成酶結合物，因此，兩步法優點是能生成均一的酶結合物，大多可使一個分子酶與一個分子球蛋白作用，抗體和酶的活性損失較少，所得酶結合物活性比一步法高10倍左右。
其方法是將10mg HRP溶於0.2ml含1.25%戊二醛的PH 6.8 0.1mol/L PBS中，置室溫18小時，充分透析或經葡聚糖凝膠G-25層析除去多餘戊二醛，加生理鹽水至1ml，然後加入5mg純化的抗體球蛋白及0.1ml PH 9.6的1 mol/L碳酸鹽緩衝液，混合後於4℃冰箱放置24小時，加入0.1ml 0.2 mol/L的賴氨酸溶液，室溫置2小時，用PH 7.2、0.15 mol/L PBS充分透析，藉離心除去沉澱，上清即為酶結合物。必要時可作進一步純化後使用。
2、過碘酸鈉氧化法：本法是目前酶標記抗體較好的方法，能使70%酶與90%以上球蛋白結合。采用本法首先是用氟代二硝基苯（Fluoro dinitro bengene 2.4—硝基苯，FDNB）封閉HRP表麵的遊離氨基（亦可用甲醛或戊二醛來封閉），從而提高酶結合抗體球蛋白的能力，避免酶的自身交聯。然後用過碘酸鈉來氧化HRP表麵結構的醣鏈部份（即低聚醣基團）使成醛基，使其直接與抗體球蛋白上的遊離氨基形成共價鍵而結合。zui後用硼氫酸鈉還原，使HRP表麵醛基能充分與抗體球蛋白上氨基進行反應，使之形成穩定的結合物。其反應式如下:
NH2 N=CH2
（1） Fe—E +HCHO----> Fe—E +H2O
CH2OH CH2OH
N=CH2 NaIO4 N=CH2
（2） Fe—E +O---->Fe— E + H2O
CH2OH CHO
N=CH2 N= CH2
（3） Fe—E +H2N-Ig---> Fe—E + H2O
CHO C=N-Ig
H
其標記步驟是：10mg HRP溶於新鮮配製的0.3 mol/L PH 8.1碳酸氫鈉2ml中，加0.2ml1%氟代二硝基苯無水乙醇溶液，室溫中攪拌1小時以封閉HRP表麵的遊離氨基。再加2ml 0.08 mol/L NaIO4水溶液，於室溫中輕攪30分鍾，用0.16 mol/L乙二醇溶液終止氧化反應。1小時後移入透析袋中置0.01 mol/L PH 9.5的碳酸鹽緩衝液中透析過夜，除去試劑，透析袋中的即為醛化酶。
取6ml醛化酶加20mg抗體球蛋白（用2ml碳酸鹽緩衝液溶解），混勻，室溫攪拌2-3小時後加10mg硼氫酸鈉鹽，4℃冰箱4小時或過夜。次日取出加等量飽和硫酸銨沉澱酶結合物（去遊離酶），並用50%飽和硫酸銨洗滌1-2次。再溶於3ml PH 7.4 PBS中，並置透析袋經透析除鹽，如有沉澱藉離心除去。上清酶結合物加入等量60%甘油PBS，分裝保存，冰箱備用。
如采用改良過碘酸鈉簡化法製備酶結合物，比原法更簡便、快速，所獲製品質量良好。其方法是取10mg HRP加1ml0.1 mol/L醋酸鈉或水溶解，充分混勻，約5分鍾後加0.08 mol/L NaIO4，水溶液1.0ml混合後，置冰箱內20分鍾，加0.4 mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應，30分鍾後加21% NaCL溶液0.3ml，再加1.2ml冰冷的無水乙醇（AR）沉澱醛化酶，離心去上清，沉澱酶再用6ml 80%冰冷的乙醇溶液浸泡洗滌一次後，離心傾去乙醇（盡量去除乙醇），沉澱用PH9.6的0.05 mol/L碳酸鈉緩衝液2ml溶解，然後加入2ml羊或馬抗人IgG（內含蛋白量20mg左右），攪拌均勻，置冰箱內過夜，次日取出加10mg NaBH4 混勻，3小時後加等量飽和硫酸銨沉澱酶結合物，離心，去上清，沉澱用50%飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉澱用0.01 mol/L PBS 3ml溶解，置透析袋中用冰冷的生理鹽水透析除鹽（需換液5次），如有沉澱藉離心除去，上清呈淡棕色即為酶結合物。加60%甘油PBS，分裝保存備用。
製備好的酶結合物，要作兩者克分子比和使用稀釋度的測定，標記率的測定（A403/A280—0.4—1.0為宜）。
1、酶結合物克分子比測定：將製備好的酶結合物經適當稀釋在分光光度計中以280nm和403nm測O.D值，然後按下列公式計算兩者的克分子比。
（1）酶戊二醛交聯法的計算：
酶量：mg/ml=O.D403nm×0.4,其中0.4為酶O.D403nm=1.0時相當於0.4mg酶。
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.42）×0.94×0.62
其中O.D403nm×0.42為酶蛋白結合戊二醛後在280nm應有的O.D，抗體球蛋白0.62為蛋白質與酶--戊二醛結合後O.D280nm值約應以加6%，故以0.94校正之。換算係數，故zui後要乘於0.62。
（2）用過碘酸納氧化法的計算：
酶量：mg/ml同上：
球蛋白量：mg/ml=（O.D280nm-O.D403nm×0.3）×0.62
其中O.D403nm×0.3為酶蛋白本身在280nm應有的O.D值。
mg/ml（酶） mg/ml（球蛋白） mg（酶）×4 克分子比=---------- ÷---------------=--------------- 40000 160000 mg（球蛋白） |
已知酶量和球蛋白量，即可求出酶結合物的克分子比。
一般要求製備好的酶結合物二者克分子比在0.8-1.2，但不能超過2或稍高。
2、酶結合物使用稀釋度測定：先將一定濃度的抗原（如為抗人酶結合物，則用1μg/ml正常人IgG）包被固相載體，洗滌後加一係列不同稀釋度之酶結合物進行孵育，洗滌加底物顯色，並終止反應。在酶標比色計中測定不同稀釋度酶結合物的O.D值，選擇O.D值≥1.0的那個酶結合物稀釋度即為本批酶結合物的使用濃度，見表中約1：12000稀釋。
| 酶結合物稀釋度 | 1：3000 | 1：6000 | 1：9000 | 1：12000 | 1：15000 | 1：18000 |
| O.D值 | 2.45 | 1.96 | 1.59 | 1.12 | 0.74 | 0.405 |
（五）洗滌劑與稀釋劑：為了使特異性結合的抗體量盡可能多，包被微量反應板凹孔的抗原應該稍微過量。但在孵育或洗滌過程中，已吸附的抗原可能有部份會從固相載體上被洗滌下來。從而使加入被檢血清中的特異性抗體以外的蛋白質很可能會吸附到原來包被抗原凹孔的空白處,增加本底顏色,產生假陽性反應,這是限製ELISA特異性的一個因素.因此不少學者在稀釋劑及洗滌劑中加入各種保護性阻劑來抑製非特異性蛋白的競爭性吸附作用。已經證明牛血清白蛋白（BSA）和吐溫—20有良好的封阻作用。其加入的量BSA為0.5%～1%；吐溫—20為0.05%。（有人曾經比較了四種洗滌劑，結果認為蒸餾水加0.05%吐溫-20或0.02 mol/L PBS（PH7.4）加0.05%吐溫-20都是良好的）。在一般的洗滌劑和稀釋劑中還加有NaN3防腐，但是用HRP製備酶結合物時則不能加NaN3，因NaN3能抑製HRP的活性，需要注意BSA加入洗滌劑或稀釋劑中雖可改善ELISA的結果觀察，但由於BSA比較昂貴，又不易得到，故也不是非加不可的。有人在洗滌劑中加入0.1%白明膠，2%免血清，有利於加強封阻作用。zui近有人報告用PH7.4 0.02 mol/L Tris-Hcl緩衝液中加入0.05%吐溫-20作洗滌劑，效果很好，被檢血清和酶結合物的稀釋劑，可與洗滌劑相同，但不需加0.2‰的KCl。
在稀釋劑和洗滌劑中所加的吐溫-20很重要。它不僅能消除非特異性的本底反應，而且還可增加陽性標本的敏感度，這可能與吐溫-20能分離所吸附的非特異性物質有關。目前采用的洗滌劑為PH7.4 PBS（含0.2‰KCL）加0.05%吐溫-20，如無吐溫-20，也可用吐溫故-40或吐溫-60代替。但吐溫-80本底較高，不宜應用。（0.5 mol/L NaCL）和2%兔血清加入稀釋劑中，可提高特異性。
（六）底物：各種酶都有對底物的特異性，所以使用不同種類的酶要求有不同的底物。一旦酶結合物已經確定（如AP或HRP），那麽可供選擇底物的範圍是很有限的。在這有限底物的範圍內如何選擇合適的底物呢？應按下列幾個條件進行選擇。（1）底物在未被酶催化以前應該是無色的，而經酶催化後有明顯的顏色變化，這樣可使結果分辨清楚；（2）所顯色澤易幹洗脫；（3）顯色後的產物要求穩定，在作定量測定時所產生的有色物質應該是可溶性的；（4）價廉，易得而且無毒。
因此，對AP酶結合物來講，一般均用硝基苯磷酸鹽，顯色後呈桔黃色，色澤穩定，用2 mol/L NaOH終止反應，可用波長403nm測定O.D值。AP催化底物產生顏色的反應如下：
O AP R—O--P—OH+H2O R—OH+H3PO4 OH 桔黃色 對硝基酚脂肪酸 對硝基酚 |
因AP是一種磷酸酯酶,它能催化磷酸酯（硝基苯磷酸鹽）水介釋放出無機磷酸而顯色。
對HRP酶結合物來說，主要通過酶的催化作用使過氧化氫還原。同時使另一個底物氧化產生色變，可供選擇的底物有幾種，過去都用5-氨基水楊酸，它經酶催化後產生棕色產物便於觀察，缺點是容易產生沉澱，用於定量測定時有困難。目前大多數使用鄰苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，簡稱OPD），穩定、敏感，其降解產物呈桔紅色，可溶。用2 mol/L H2SO4或檸檬酸終止反應，可在492nm波長的酶標比色計上測定O.D值，也可目測。HRP在催化反應中可使H2O2分解出新生態氧，本身還原成水，而使OPD氧化生成有色產物，反應式如下：
NH2 NH NH NH2 HRP NH NH +H2O2-------> +2H2O O.P.D 桔紅色 |
O、P、D對光不穩定，故加後需放暗處作用。但據報告有致突變性，
O.P.D對光不穩定，故加後需放暗處作用，但據報告有致突變性，使時需注意。此外尚可選用鄰聯甲苯胺（Ortho-Toli dine，簡稱OT），顯色以後呈蘭色，可用波長630nm測O.D值，不需終止反應。也可用目測，但顯色後不穩定，40分鍾色澤會自行減退，故需及時測定結果。加終止劑後呈現黃色，則需用波長405nm測定O.D值。
底物配製方法如下：
1、用O.P.D作底物：先配製PH5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液。取0.1 mol/L（19.2克/升），檸檬酸溶液24.3ml，加0.2 mol/L（27.4克/升）Na2HPO4溶液25.7ml，再加蒸餾水50ml，然後將40mgO.P.D溶解其中，再加30% H2O2 0.10ml即可應用，用時新鮮配製、避光。
2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸鹽緩衝液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸鈉（16.4克/升）溶液等量混和，然後稱取OT 21.2mg先溶於1ml二甲基乙酰胺中，再將OT溶液傾入100ml PH3.7的醋酸鹽緩衝液中，並加入30%H2O2 0.05ml即得，用前新鮮配製。
（七）作用時間：加底物後要多長時間終止反應測定結果呢？一般可采取二種方法。
1）任意確定一個時間，如20分鍾或30分鍾終止反應，測定被檢標本和陽性參考標本的O.D值。這樣所得的數據要進行校正，校正可按下列公式：
1.0 校正後O.D值=被檢標本的O.D值×------------------- 陽性標本的O.D值 |
2）製備好一批酶結合物後預試時間，在反應溫度固定時，當陽性參考血清O.D值達到1.0時終止反應，記錄這個時間，如30分鍾，以後用本批酶結合物測定待檢樣品時都采用同一時間終止反應，這個辦法不需要校正，比較方便。
國外在使用自動測定儀時，加底物後隨時測定，每塊試驗板上陽性參考血清的O.D值，當其達到1.0時，立即將全板上被試標本終止反應進行測定，這樣所得結果比較一致。我國也有自動酶標測定儀，但由於固相載體不夠均勻，也很難用板來直接測定。
在ELISA中所加酶結合物之濃度，加後孵育時間以及加底物後孵育時間。這三個因素也是互相有影響的。一般講，酶結合物濃度低，則要求孵育時間長些，而酶結合物濃度高則要求孵育時間短些，可根據實驗的具體情況，變更不同因素，以取得良好的結果。
由於ELISA中變異因素多，對於要診斷某一疾病時，必須進行一係列實驗室預試，摸索，或叫實驗研究，在酶結合物已經確定的情況下，一般要求預測以下5個條件：
（1）抗原包被濃度；
（2）被檢血清稀釋度，即測劑量反應曲線；
（3）*抗體作用時間；
（4）酶結合物作用時間；
（5）底物作用時間。
一旦試驗條件摸清，以後在正式測定時，必須固定條件，不要隨時改變，以使試驗係統保持足夠的穩定性。
（八）結果判斷:ELISA的試驗結果可用肉眼觀察顏色反應的深淺作出判斷，也可用分光光度計作測定。當然,後者更為正確。而肉眼觀察更為簡便，而且也有一定正確性。據Adler（1980）報告,目測為±1+、2+、3+、4+相當於分光光度計測定O.D值。
不論用哪種方法判定結果，每次都要有陽性和陰性參考血清作對照，這樣可以消除一些外界的影響因素。
≤0.04“±” 0.06～0.092和0.08～0.25“+”
0.26～0.5“++” 0.51～1.0“+++” > 1.0“++++”
（九）試驗的重複性（度），有二種方法來檢驗試驗的度：通常用變異係數來表示：1、幾個樣品用ELISA法同時進行多次測定求出CV%；2、不同時間對不同操作者對某幾個樣進行多次測定求出變異係數。CV是個體參數標準差與平均數的比率。
S / X ＝ CV ，CV應低10%，不應大於10～15%。
不論目測或分光光度計測定，均可作一個稀釋度或一係列稀釋度測定，一般常規診斷隻用一個稀釋度判斷陽性或陰性就可以了，這樣比較方便，現在推薦傳染病的血清診斷用1：200一個稀釋度。有些需要定量的，可作一係列稀釋度測定。
記錄結果有下列幾種方法：
1、“+”或“-”：所有超過規定的O.D值（如O.D，0.4）的標本均屬陽性，此規定O.D值是根據事先測定大量陰性標本所取得的，此規定值是陰性標本的上限。或者以一組陰性標本O.D平均值加2～3個標準差作為陽性閾值。
2、直接以O.D值來表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越大，陽性反應越強，但此數值是在固定實驗條件下得到的結果，而且每次實驗都要有參考標本作對照。
3、以終點滴度表示：將標本作連續稀釋，zui高稀釋度能出現陽性反應者（即OD值仍大於陽性閾值，即為該標本的滴度。
4、以“比值”表示：求出被檢標本的O.D值與一組陰性標本O.D值的比值，例如為陰性標本的2倍或3倍，即為陽性，比值小於2.1而大於1.5為可疑，<1.5為陰性。
測定標本O.D值-空白O.D值
—————————————≥2.1
陰性對照O.D值-空白O.D值
如在此測定時以空白校正“O”點。
5、以“單位”來表示：在測定被檢標本的同時，再測定一個含已知單位數的陽性參考血清，用不同稀釋度作ELISA檢測後，以O.D值為縱坐標，單位數為橫坐標，畫出標準曲線。以後可根據被檢標本的O.D值，從曲線上找出相應的單位數，再乘於血清的稀釋倍數，即可得出被檢標本的單位數。
作試驗時的陰性參考血清不要顯色，否則會對結果判斷帶來困難，特別在目測時，當陽性標本O.D值>2.0時，應作適當稀釋後再作測定。
（十）對使用儀器要求：所用儀器如吸管、燒杯試管都要清潔，用於酶結合和底物的吸管和容器一定要分開。試劑要求標準化。
四、具體操作法
上麵已經把ELISA中各步驟的影響因素作了說明，為了便於工作下麵把ELISA的操作程序列於表1供參考：
表1：ELISA操作步驟
| 方法 步驟 | 間接法（測抗體(ti) ） | 雙抗體(ti) 夾心法 （測抗原） | 競爭(zheng) 法（測抗原） | 抑製性測定法 |
| 1 | 包被抗原：用包被緩衝(chong) 液稀釋抗原至zui適濃度（5～20μg/ml）各0.3ml加於(yu) 微反應板每個(ge) 凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時,貯存冰箱 | 包被抗體(ti) ：用包被緩衝(chong) 液稀釋特異性抗體(ti) 球蛋白至zui適濃度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時，貯存冰箱 | 包被特異性抗體(ti) ： 同左 | 包被抗原： 同左 |
| 2 | 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩衝(chong) 液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鍾 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 3 | 加被檢標本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩衝(chong) 液稀釋的被檢血清各0.2ml，37℃，作用1～2小時 | 每凹孔加入0.2ml用稀釋緩衝(chong) 液稀釋的含抗原的被檢標本，37℃作用1～2小時。 | 分2組,a組加酶標記抗原和被檢抗原混合液0.2ml，另一組隻加酶標記抗原液0.2ml，37℃作用1～2小時。（混合液可作成不同稀釋度）。 | a組加參考抗體(ti) 和被檢抗原混合液0.2ml，另一組加參考抗體(ti) 與(yu) 等量稀釋劑0.2ml，37℃作用1～2小時。 |
| 4 | 洗滌：重複2 | 同左 | 洗滌：同左 | 洗滌 |
| 5 | 加入酶結合物：每凹孔加入稀釋緩衝(chong) 液稀釋的酶結合物0.2ml 37℃作用1～2小時 | 加入0.2ml用稀釋緩衝(chong) 液稀釋的酶標記特異性抗體(ti) 溶液，37℃作用1～2小時或由預試實驗確定作用時間。 | | 各加入0.2ml抗參考抗體(ti) 的酶結合物37℃作用1～2小時 |
| 方法 步驟 | 間接法（測抗體(ti) ） | 雙抗體(ti) 夾心法 （測抗原） | 競爭(zheng) 法（測抗原） | 抑製性測定法 |
| 6 | 洗滌：重複2 | 同左 | | 洗滌 |
| 7 | 加入0.2ml底物溶液於(yu) 每個(ge) 凹孔,（O.P.D或O.T），室溫作用30分鍾（另作一空白對照，0.4ml底物加0.1ml終止劑）。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 8 | 加終止劑：每凹孔加2M H2SO4或2M檸檬酸0.05ml。 | 同左 | 同左 | 同左 |
| 9 | 觀察記錄結果：目測或用酶標比色計測定（O.P.D用492nm）O.D值。 | 同左 | 用酶標比色計測定a、b兩(liang) 組O.D值，並求出a、b、O.D值的差數 | 同左 |
五、ELISA的應用
ELISA應用的範圍很廣，而且正在不斷地擴大，原則上ELISA可用於檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。酶免疫試驗（EIA）結合光學顯微鏡或電子顯微鏡可進行抗原定位與結構的研究，用酶標記抗原或抗體結合免疫擴散及免疫電泳可提高試驗的敏感性。在實際應用方麵可作疾病的研究診斷、疾病監察、疾病普查、法醫檢查、獸醫及農業上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學、免疫學、微生物學、藥理學、流行病學及傳染病學等方麵密切相關。
檢查抗原和半抗原方麵：在內分泌方麵已經用於檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當，在血液學方麵可用於檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細胞抗原及結合球蛋白（Hapto Globin）等，在腫瘤方麵已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），對前者的敏感性已達到與放射免疫試驗相當的水平，但對CEA檢查的敏感性較低，目前尚不能用於常規診斷,在傳染病的診斷方麵正在日益擴大，其中zui滿意的是用於檢查乙型肝炎表麵抗原。國內外已有ELISA檢測的商品供應。尚有用於檢查霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿杆菌和破傷風梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢查免疫抑製樣本中常見的白色念殊菌抗原，檢查樣本或病獸的糞便中的輪狀病毒，自樣本標本中檢查甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細胞病毒等。還可用於植物組織漿液中檢查植物病毒。此外尚試用於測鉤體抗原及血吸蟲病的循環抗原等。在免疫化學方麵可用於檢測白蛋白，免疫球蛋白的各種組份，也可用於檢測補體成份，如：ciq，還能用於檢測蛇毒。
檢查抗體方麵：用ELISA間接法檢查抗體，已獲得對多種傳染病和寄生蟲病的血清學診斷，亦開始廣泛用於現場流行病學調查。在寄生蟲病方麵，它用於對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、囊蟲、弓漿蟲、肺吸蟲、肝吸蟲、血絲蟲、旋毛蟲病等血清學診斷，這對人醫和獸醫都很重要。在病原微生物方麵已用於檢查鏈球菌、沙門氏菌、布氏杆菌、結核杆菌、麻瘋杆菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用於破傷風抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測定以及檢測斑疹傷寒立克次氏體感染後的抗體，可作診斷。對立克次氏體還可用以鑒別密切有關的種屬。也有用於檢查鸚鵡熱衣原體抗體的報導。試用於病毒抗體檢查報告的有：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質炎病毒等，其敏感性都超過目前常用的檢查方法。此外，還可用於鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。如能進一步改進方法用於檢查特異性IgM，可以作為早期診斷以及了解體內有關抗原的清除情況。在免疫性疾病方麵有試用作自身疫病抗體測定以及對過敏的診斷，例如檢測各種過敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛生學方麵，可用於檢測食品中葡萄球菌腸毒素及沙門氏菌毒素等等。
六、ELISA存在的問題
從以上的簡單介紹中可以看出，ELISA法由於本身所具備的*性，是一項很有發展前途的血清學診斷方法，而且應用的領域也越來越廣泛。但是我們認為ELISA不是萬應良方，用它來代替一切，這是不當的。因為ELISA法還有局限性：
1、由於ELISA所用的抗原大部分還是混合的可溶性抗原，所以對同一微生物寄生蟲或其他物質不同部位的抗原還沒有分開。
2、內源性過氧化酶的普遍存在，如人腦組織中，呼吸道分泌物的炎症細胞中及某些病毒的組織培養中均有內源性過氧化物酶的活力，常不易除去，如果用某些方法除去時，則病毒的抗原性亦受到破壞，對於用ELISA檢測不利。
3、對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完善，因此，對出現一些非特異性反應的時候，往往不易解釋。
4、固相載體的質量常不統一，主要是原料及製備工藝還不一致，致使不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能很差，影響試驗結果。
5、試劑不統一，現在處於“八仙過海，各顯神通”，標準還不能統一。
下麵將ELISA法與免疫熒光（IFA）和放射免疫（RIA）的各自優缺點作一簡要的比較（表4）,供參考:
表4:三種方法的優缺點比較:
| 方法種類 比較指標 | ELISA | RIA | IFA |
| 敏感性 | 高 | 高 | 較低 |
| 特異性 | 取決(jue) 於(yu) 抗原製備 | 同左 | 較高 |
| 重演性 | 尚滿意 | 尚滿意 | 尚滿意 |
| 結果判斷 | 客觀 | 客觀 | 有主觀因素 |
| 抗原製備 | 較容易或複雜 | 同左 | 較容易 |
| 結合物製備 | 正在標準化 | 已標準化 | 已標準化 |
| 在野外條件下用於(yu) 大量人群標本的普查 | 可以 | 困難 | 尚可以 |
| 分析自動化 | 可以 | 可以 | 困難 |
| 主要設備 | 酶標比色計 | 粒子計數器 | 熒光顯微鏡 |
| 試驗成本 | 低 | 高 | 較高 |
| 試劑半衰期 | 長 | 短 | 長 |
| 對人的危害性 | 無或很少 | 有 | 無或很少 |
| 主要檢測對象 | 抗體(ti) 或抗原 | 抗原 | 抗原或抗體(ti) |
| 應用範圍 | 小的診斷實驗室 | 大的中心實驗室 | 小的診斷試驗室 |
綜上所述，ELISA在國內外已使用得非常廣泛，但對該法在應用中的評價尚不一致，過去在ELISA法開始建立時有全麵肯定的趨勢，而在廣泛研究和實踐中發現了一些缺點，遇到了一些困難，如在重演性問題、特異性問題以及能否考核療效問題等等。所以在70年代末期也有人采取否定的態度，全麵肯定或全盤否定，這些都是不正確的，對一種新方法的建立和深入研究，要采取一分為二的方法加於評價，既要看到方法的優點，也要重視存在的問題，便於進一步研究加以克服。世界衛生組織專家組提出對ELISA的評價認為：“ELISA作為免疫診斷應用是一個好辦法，但要做好它不容易。”因此，還需進一步研究改進，加以完善。從而使之成為對多種疾病診斷較為理想的方法是*可能的。
更新時間：2013-05-27 
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