信帆生物：皮質醇ky体育在线登陆的正確操作方法

小鼠皮質醇（Cortisol）ELISA檢測試劑盒的正確使用方法

信帆生物供應各類ky体育在线登陆，提供免費代測服務，產(chan) 品質量穩定，庫存充足。

【檢驗原理】

試劑盒采用酶聯免疫分析方法。采用生物素標記Cortisol，純化的抗Cortisol抗體(ti) 包被微孔板，在競爭(zheng) 抑製反應中，一定量的固相抗體(ti) 與(yu) 生物素標記Cortisol及非標記抗原（校準品或標本）進行抑製競爭(zheng) 反應，抗體(ti) 與(yu) 生物素標記的Cortisol結合量受非標記抗原量所抑製，非標記抗原量多,抗體(ti) 與(yu) 生物素標記的Cortisol結合就少，反之結合就多；反應平衡後，形成固相抗體(ti) -生物素化Cortisol，再加入酶標記的親(qin) 和素，形成固相抗體(ti) -生物素化Cortisol-酶標-親(qin) 合素複合物。經加底物顯色後，用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值）。隨著Cortisol濃度的升高，OD值逐漸下降呈良好的線性關(guan) 係。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、重複性好、操作簡單、快速等特點，對血清中Cortisol的減少或升高有可靠的檢出性能。

【主要組成成分】

主要成分

標準品濃度依次為(wei) ：12、6、3、1.5、0.75、0 ng/mL本品必須按照具有潛在的感染性進行處理，處理過程應當遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

 1、酶標儀(yi)

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、500ml量筒

7、無粉一次性乳膠手套

【儲(chu) 存條件及有效期】

 1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個(ge) 月。

 2、開封使用後，包被微孔板放入帶有幹燥劑的自封袋中，密閉自封袋，並將全部試劑放回2-8℃冰箱。

 3、開封後，按照建議的條件保存，校準品、包被微孔板和HRP標記抗體(ti) ，有效期為(wei) 14天，其他成分在標簽標明的有效期內(nei) 是穩定的。

【適用儀(yi) 器】

 半自動的酶標儀(yi) ，如Thermo MK3，或者國產(chan) 酶標儀(yi) 。

【樣本要求】

 樣本類型和采集

以下隻是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為(wei) 防腐劑。

1、細胞培養(yang) 上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反複凍融。

2、血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反複凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為(wei) 抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鍾取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反複凍融。

4、組織：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)衝(chong) 洗組織，去除殘留血液，稱重後將組織剪碎。將剪碎的組織與(yu) 對應體(ti) 積的PBS(一般按1: 9的重量體(ti) 積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體(ti) 體(ti) 積可根據實驗需要適當調整，並做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑製劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為(wei) 了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反複凍融。最後將勻漿液5000×g離心 5-10分鍾，取上清檢測。

樣本保存和穩定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲(chu) 存72h，或者在- 20℃儲(chu) 存6個(ge) 月。樣本收集後，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反複凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗方法】

試劑準備

1、使用前，所有的組分都要至少複溫30min，確保充分複溫到室溫。

2、濃縮洗滌液：從(cong) 冰箱取出的濃縮洗滌液，會(hui) 有結晶產(chan) 生，這屬於(yu) 正常現象，水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與(yu) 蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

操作程序

1.      將各種試劑移至室溫平衡兩(liang) 小時，取濃縮洗滌液，根據當批檢測數量，用蒸餾水1：20稀釋，混勻後備用。

2.      將預包被板從(cong) 密封袋中取出，設一個(ge) 空白對照孔，不加任何液體(ti) ；每個(ge) 校準品設2孔，每孔加入對應校準品50μl；其餘(yu) 每個(ge) 檢測孔直接加待測血清或質控品50μl。

3.      除空白孔外所有孔加入生物素化抗原50μl，混勻，貼上封板膜，置37℃溫育60分鍾。

4.      手工洗板：棄去孔內(nei) 液體(ti) ，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩幹，重複3次後拍幹。洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板後拍幹。

5.      每孔加入酶標親(qin) 合素50μl（空白對照孔除外），混勻，貼上封板膜，置37℃溫育30分鍾。

6.      手工洗板：棄去孔內(nei) 液體(ti) ，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩幹，重複3次後拍幹。洗板機洗板：選擇洗滌3次程序洗板後拍幹。

7.      每孔加顯色劑A 50μl，顯色劑B 50μl，振蕩混勻後，置37℃避光顯色15分鍾，每孔加終止液50μl。

8.      用酶標儀(yi) 讀數，取波長450nm，先用空白對照孔調零點，然後測定各孔光密度值（OD值）。

【實驗結果計算】

檢測完成後，以標準品濃度做為(wei) 縱坐標，對應的吸光度（OD值）作為(wei) 橫坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。

【檢驗方法的局限性】

1、僅(jin) 供科研使用，不得用於(yu) 臨(lin) 床診斷。

2、在試劑盒標示的有效期內(nei) 使用，過期產(chan) 品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高於(yu) 最高標準品濃度值，請將樣本適當稀釋後，再重新測定。

6、通過其他方法得到的檢測結果，與(yu) 本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

【產(chan) 品性能指標】

1.  外觀和物理檢查:試劑盒應組分齊全，內(nei) 外包裝均應完整，標簽清晰，液體(ti) 試劑無滲漏。各組分裝量不少於(yu) 表1中要求。

2.  線性: 用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），在0.375 ng/mL – 12 ng/mL範圍內(nei) ，劑量-反應曲線相關(guan) 係數（r）的絕對值應不低於(yu) 0.9900。

3.  精密度

3.1分析內(nei) 精密度:試劑盒質控品測定結果的變異係數（CV）應不大於(yu) 15.0%。

3.2批間精密度:在三個(ge) 不同批次產(chan) 品之間，質控品測定結果的變異係數（CV）應不大於(yu) 15.0%

4.  低檢出限:低檢測濃度小於(yu) 0.1 ng/mL。

5.       質控品測定值: 每次檢測結果均應在允許範圍內(nei) 。

【注意事項】

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規範的規定，嚴(yan) 格防止交叉汙染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳(chuan) 染物進行處置。

2、試劑盒的液體(ti) 組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應，避免吸入煙霧與(yu) 皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成後洗手。

技術提示

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準品與(yu) 樣本時，每個(ge) 校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應該懸臂加樣，避免交叉汙染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結果準確性的必要條件。

4、底物溶液為(wei) 無色液體(ti) ，保存過程中變為(wei) 藍色，代表底物溶液已經失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與(yu) 底物溶液加樣順序一致，加入終止液後，藍色底物產(chan) 物，會(hui) 瞬間變為(wei) 黃色。

6、實驗中，用剩的板條，應立即放回自封袋中，密封（低溫幹燥）保存。

7、所有液體(ti) 組分，使用前充分搖勻，嚴(yan) 格按照說明書(shu) 標明的時間、加樣量及加樣順序進行溫育操作。

廢物處理

 所有使用或未使用的試劑，所有汙染性的一次性材料，應當遵循傳(chuan) 染性或潛在傳(chuan) 染性產(chan) 品的處理程序，每個(ge) 實驗室都有責任根據其實驗的類型和危險性級別，進行廢物和汙物的處理，同時要嚴(yan) 格依照有關(guan) 規定對待所有的廢物和汙物。

免責聲明

1.  試劑盒僅(jin) 供研究使用，不得用於(yu) 臨(lin) 床實驗或人體(ti) 實驗，否則所產(chan) 生的一切後果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.  嚴(yan) 格按照說明書(shu) 中標明的時間、加液量及順序進行操作，實驗者違反說明書(shu) 操作，後果由實驗者承擔。

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