植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟

植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟

產(chan) 品簡介：

植物組織在脅迫環境條件下會(hui) 產(chan) 生多種活性氧（ROS），ROS 活性非常大且極其不穩定，因此 ROS 的檢測通常因其最終產(chan) 物而定。超氧陰離子是活性氧的一種，屬於(yu) 一種含氧自由基，能將 NBT（氮藍四唑）還原成不溶於(yu) 水的藍色甲瓚化合物，從(cong) 而定位組織中的超氧陰離子。

植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)根據上述基本原理也稱為(wei) NBT 染色法，用於(yu) 植物活組織中的超氧陰離子染色。一般應用於(yu) 較嫩的根尖、葉片等的整體(ti) 染色，染色後有超氧陰離子聚集的部位呈藍色至深藍色。該產(chan) 品僅(jin) 用於(yu) 科研領域，不用於(yu) 臨(lin) 床診斷或其他用途。

自備材料：

1、新鮮的植物葉片或根、自來水、蒸餾水、95%乙醇

2、超聲波、磁力攪拌器、電子天平、濾紙、照相機

操作步驟(僅(jin) 供參考)：

1、試劑準備：將 50 mg NBT 加入到 100mL 磷酸緩衝(chong) 液(pH 7.4) 中充分溶解，即得 NBT染色工作液，2-8℃避光保存，一月內(nei) 有效。注：如果較難溶解，可通過超聲、磁力攪拌等方法促溶。

2、樣本準備：采集經脅迫（例如重金屬）的采集植物幼苗或根尖，自來水稍洗淨，置於(yu) 濾紙上吸幹多餘(yu) 水分。

3、染色：將植物幼苗或根尖浸入 NBT 染色工作液中，常溫避光浸染 2~6 h，至陽性部位出現深藍色，其餘(yu) 部位為(wei) 淡藍色或近無色或呈植物本身的顏色即可。（根據植物幼嫩程度。顯色程度調整染色時間）

4、脫色：用鑷子將植物幼苗或者葉片小心取出，浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次，置於(yu) 濾紙上吸幹多餘(yu) 水分後，浸入 95%乙醇中 40℃處理 3~16 h，目的是脫去植株幼苗或者葉片本身的葉綠素或者淡藍色背景，處理期間可多次更換新鮮的 95%乙醇。

5、觀察：用鑷子取出植株幼苗或者葉片，浸入蒸餾水中來回漂洗 3~5 次，置於(yu) 濾紙上吸幹多餘(yu) 水分後，將樣本轉入適量 NBT 樣本保存液中浸泡 30 min 後，隨後可取出拍照。樣本可置於(yu) 該溶液中常溫保存一周。

注意事項：

1、NBT 染色工作液配製好以後需 2-8℃避光保存，一月內(nei) 使用。存放時間過久，會(hui) 影響顯色。

2、因任何外在因素都可能刺激植物應激產(chan) 生超氧陰離子，因此植物樣本需要新鮮采集，並盡快完成染色。建議做陰性及陽性空白對照組。

3、樣本染色完成後盡快拍照保存結果。

4、染色和脫色步驟也可參考如下建議操作：組織放入染液中，抽真空，-0.1MPa 保持負壓20~30min，再於(yu) 室溫下靜置染色 60min，棄染色液；加入 95%乙醇，於(yu) 70~80℃水浴鍋脫色，每隔 10min 換一次 95%乙醇，待樣品綠色全部褪去後可停止脫色。

5、為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

植物超氧陰離子染色液(NBT,pH7.4)操作步驟