PCR實驗代測的模板濃度

PCR實驗代測的模板濃度

 服務內(nei) 容：

1.製定個(ge) 性化實驗方案：根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內(nei) 參；

2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；

3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提，並利用NanoDrop進行樣本質檢；

4.定量PCR預實驗：包括樣本反轉錄為(wei) CDNA、配置PCR反應體(ti) 係及進行Real-TimePCR反應；

5.正式定量PCR實驗：根據預實驗結果進行正式實驗；

6.數據分析：采用2- △△CT法進行分析，比較不同樣本間差異。

影響Ct值的關(guan) 鍵因素

模板濃度

模板濃度是決(jue) 定Ct的最主要因素。控製在一個(ge) 合適範圍內(nei) ，使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會(hui) 影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與(yu) PCR擴增效率高的條件下相比，可能會(hui) 所產(chan) 生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決(jue) 於(yu) 實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

Real-time qPCR常見參數

基線（baseline）通常是3-15個(ge) 循環的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值（threshold）

自動設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置：置於(yu) 指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對於(yu) 同一個(ge) 基因擴增一定要用同一個(ge) 閾值。

Ct值:與(yu) 起始濃度的對數成線性關(guan) 係。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(hui) 導致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與(yu) 參比染料的熒光發射強度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。

如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率：為(wei) 了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個(ge) 數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。

另一個(ge) 評估PCR效率的關(guan) 鍵參數是相關(guan) 係數R2，它是說明兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 程度的統計學術語。如果R2等於(yu) 1，那麽(me) 你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等於(yu) 0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大於(yu) 0.99 時，兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 的可信度很好。

PCR實驗代測的模板濃度