抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步驟

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步驟

抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是破骨細胞的標誌性酶，特異性分布於(yu) 破骨細胞中。TRAP染色試劑盒即是用於(yu) 顯示組織中的破骨細胞。其中基本原理在於(yu) ，在含酒石酸的酸性條件下，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能將萘酚AS-BI磷酸鹽水解，產(chan) 生的萘酚AS-BI與(yu) 六偶氮副品紅結合，形成非水溶性的酒紅色物質沉積在酶活性原位，從(cong) 而實現對抗酒石酸酸性磷酸酶的顯色和定位。本產(chan) 品基本組成成分：反應緩衝(chong) 液主要成分為(wei) 醋酸緩衝(chong) 液及酒石酸鉀鈉，pH約5.0；副品紅溶液，含5%副品紅；亞(ya) 硝酸鈉溶液主要成分為(wei) 4%亞(ya) 硝酸鈉；AS-BI磷酸鹽底物溶液，主要成分為(wei) 20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸鹽。經本產(chan) 品染色後，破骨細胞中的TRAP呈酒紅色，定位於(yu) 細胞漿。按照切片上每個(ge) 組織點300 μL用量，本試劑盒可以做50次以上TRAP染色。

儲(chu) 存與(yu) 運輸：冰袋（wet ice）運輸；2-8℃避光保存，其中AS-BI磷酸鹽底物溶液-20℃保存，有效期12個(ge) 月。

配製TRAP工作液：

（1）取50 μL副品紅溶液（G1050-2）與(yu) 50 μL亞(ya) 硝酸鈉溶液（G1050-3）在潔淨離心管中混勻，得到六偶氮副品紅溶液；

（2）向第1步的100 μL六偶氮副品紅溶液中加入100 μL AS-BI磷酸鹽底物溶液（G1050-4），吹吸數次充分；

（3）吸取1.8 mL反應緩衝(chong) 液（G1050-1）加入到第2步的混合液中充分混勻；

（4）第3步的混合液經針式濾器過濾（0.45 μm水係濾膜）即得到TRAP工作液。

注意：務必按照所屬順序配製工作液。每個(ge) 組織點大約需要200-300 μL工作液，根據使用量配製，現配現用，避免浪費。

石蠟切片操作步驟（供參考）

1. 石蠟切片脫蠟至水，純水洗數分鍾。

2. 將切片用組化筆化圈後放在（加有一定量的防止切片蒸幹的純水）濕盒中，用純水37℃孵育2 h。

3. 切片孵育完成後傾(qing) 去純水，滴加過濾好的TRAP工作液覆蓋組織，置於(yu) 37℃避光反應20-30 min。

4. 複染細胞核：傾(qing) 去孵育液並水洗，以蘇木素染液進行染核。

5. 脫水，透明，以中性樹膠封片。

細胞爬片操作步驟（供參考）

1. 細胞固定：吸除細胞培養(yang) 液，加入4%多聚醛固定15-30 min，蒸餾水洗3次。

2. 細胞破膜：以0.2% Triton X-100溶液覆蓋細胞進行破膜處理20-30 min，蒸餾水輕洗3遍。

3. 孵育染色：將TRAP工作液加到細胞孔板內(nei) 覆蓋細胞，37℃避光孵育20 min，蒸餾水洗3次。

4. 細胞核複染：吸除孵育液並水洗，以蘇木素染液進行染核。

5. 加入適量無水乙醇脫水，取出孔板中的蓋玻片，吹風機吹幹，倒扣在潔淨的載玻片上以中性樹膠封片。

實驗流程：脫蠟至水—染液配製-Trap染色-蘇木素淺染核-脫水封片-顯微鏡鏡檢 　　

結果判讀：破骨細胞呈酒紅色或淺紅色，細胞核呈淺藍色

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步驟