人轉化生長因子β1（TGF-β1）檢測試劑盒(ELISA方法) 的正確使用方法

人轉化生長因子β1（TGF-β1）檢測試劑盒(ELISA方法) 的正確使用方法

檢測原理

試劑盒采用雙抗體(ti) 夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人轉化生長因子β1（TGF-β1）捕獲抗體(ti) 的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體(ti) ，經過溫育並底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人轉化生長因子β1（TGF-β1）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液後，3000轉離心10分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鍾取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鍾去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鍾取上清。

5.  保存：如果樣本收集後不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存於(yu) -20℃，避免反複凍融，在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.     酶標儀(yi) （450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡60分鍾。從(cong) 冰箱取出的濃縮洗滌液會(hui) 有結晶，這屬於(yu) 正常現象，水浴加熱使結晶全溶解後再使用。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鍾。

2.  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫幹燥）保存。

3.  預處理後的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。

4.  嚴(yan) 格按照說明書(shu) 中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.  所有液體(ti) 組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品濃度依次為(wei) ：24、12、6、3、1.5、0 ng/mL.

試劑的準備

 20×洗滌緩衝(chong) 液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩衝(chong) 液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，靜置1min後甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，在吸水紙上拍幹，如此洗板5次。

2.  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從(cong) 室溫平衡60min後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘(yu) 板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；

4.  隨後標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體(ti) 100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體(ti) ，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nei) ，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結果判斷

 繪製標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪製出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值，大於(yu) 等於(yu) 0.9900。

2.  靈敏度：低檢測濃度小於(yu) 0.1 ng/mL。

3.  特異性：不與(yu) 其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重複性：板內(nei) 變異係數小於(yu) 10%、板間變異係數小於(yu) 15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(ge) 月

免責聲明

1.   試劑盒僅(jin) 供研究使用，不得用於(yu) 臨(lin) 床實驗或人體(ti) 實驗，否則所產(chan) 生的一切後果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2.   嚴(yan) 格按照說明書(shu) 操作，實驗者違反說明書(shu) 操作，後果由實驗者承擔。

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