專業的RT-PCR實驗代測服務商

專(zhuan) 業(ye) 的RT-PCR實驗代測服務商

服務內(nei) 容：

1.製定個(ge) 性化實驗方案：根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內(nei) 參；
2.檢測類別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質檢：對客戶提供樣本進行RNA抽提，並利用NanoDrop進行樣本質檢；
4.定量PCR預實驗：包括樣本反轉錄為(wei) CDNA、配置PCR反應體(ti) 係及進行Real-TimePCR反應；
5.正式定量PCR實驗：根據預實驗結果進行正式實驗；
6.數據分析：采用2- △△CT法進行分析，比較不同樣本間差異。

服務要求：
1.請提供組織樣本，細胞樣本，血漿或血清樣本，totalRNA；
2.請提供已知的全長基因序列或GeneBank號；
3.請提供盡可能詳細的背景資料：DNA/RNA來源、基因豐(feng) 度等。

結果內(nei) 容：整理好的報告，樣本收到之日起5個(ge) 工作日內(nei) 反饋質檢結果。

結果展示：

樣本質檢圖

溶解曲線：

擴增曲線

數據統計

每個(ge) 指標有2張圖。一張是擴增曲線，另一張是熔解曲線，用來證明PCR擴增中無非特異性擴增

送樣運輸要求：

1. 樣品處理

a. 動物組織：常規組織，脂肪組織，結締組織，纖維化組織適當增加。將組織剪切成合適大小後（建議組織塊長寬高均不大於(yu) 0.5 cm），然後迅速浸泡於(yu) 5～10倍體(ti) 積的RNAsolidTM試劑中。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經平衡一段時間後，可從(cong) 溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回RNAsolidTM試劑中；有些比較弱的液體(ti) 滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進行RNA保護。）

b.植物組織：新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大小（建議長寬高均不大於(yu) 0.5 cm）後，然後迅速浸泡於(yu) 5～10倍體(ti) 積的RNAsolidTM試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表麵的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透，對於(yu) 此類組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c.細胞等樣本：收集不小於(yu) 10^6個(ge) 細胞的沉澱（用PBS清洗1-2次）。之後迅速加入5～10倍體(ti) 積的RNAsolidTM試劑。

d.酵母、細菌等樣本：離心棄上清，收集小米粒大小的單菌體(ti) 沉澱，然後迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒菌體(ti) 沉澱。

e. RNA樣品： OD260/280為(wei) 1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體(ti) 積≥20μL，幹冰運輸。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL，幹冰運輸。

2. 樣品保存及運輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以後部分組織中的RNA會(hui) 開始降解。室溫（25℃）穩定保存1周，不會(hui) 有明顯的RNA降解發生。大部分樣品置於(yu) RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩定保存1個(ge) 月，不會(hui) 有明顯的RNA降解發生。長期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過夜，然後將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長期穩定保存3～5年。

關(guan) 於(yu) Real-time qPCR如何進行數據分析

1. Real-time qPCR常見參數

基線（baseline）

通常是3-15個(ge) 循環的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值（threshold）

自動設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍

手動設置：置於(yu) 指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對於(yu) 同一個(ge) 基因擴增一定要用同一個(ge) 閾值。

Ct值:與(yu) 起始濃度的對數成線性關(guan) 係。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(hui) 導致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與(yu) 參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。

2. 影響Ct值的關(guan) 鍵因素

模板濃度

模板濃度是決(jue) 定Ct的最主要因素。控製在一個(ge) 合適範圍內(nei) ，使Ct在15-35之間

反應液成分的影響

任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會(hui) 影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與(yu) PCR擴增效率高的條件下相比，可能會(hui) 所產(chan) 生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決(jue) 於(yu) 實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率：為(wei) 了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個(ge) 數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。

另一個(ge) 評估PCR效率的關(guan) 鍵參數是相關(guan) 係數R2，它是說明兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 程度的統計學術語。如果R2等於(yu) 1，那麽(me) 你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等於(yu) 0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大於(yu) 0.99 時，兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 的可信度很好。

標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。

如果許多數據點都靠近平均值，那麽(me) 標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重複次數產(chan) 生的數據組會(hui) 形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向於(yu) 正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那麽(me) 2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為(wei) 1個(ge) Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小於(yu) 等於(yu) 0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為(wei) 了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小於(yu) 等於(yu) 0.250

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