免疫組化染色實驗步驟

免疫組化染色實驗步驟

免疫組織化學技術(IHC) 現在發展的已經很成熟了，應用範圍也比較廣泛，涉及到各個(ge) 學科，也是臨(lin) 床醫學專(zhuan) 業(ye) 的需要掌握的基礎技術之一。免疫組化是應用抗原和抗體(ti) 特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體(ti) 的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nei) 抗原，對其進行定位、定性及定量的研究。是臨(lin) 床病理診斷與(yu) 科學研究中的一種方法，其中石蠟組織的免疫組化染色是的技術。

一、 脫蠟和水化  

Note！脫蠟前將組織芯片放在60℃恒溫箱中烘烤2~3小時

1) 置於(yu) 二甲苯I中浸泡10分鍾，在二甲苯II中浸泡10分鍾，在二甲苯III中浸泡10分鍾，在二甲苯Ⅳ中浸泡10分鍾；  

2) 無水乙醇I中浸泡5分鍾在無水乙醇II中再浸泡5分鍾；

3) 95%乙醇中浸泡5分鍾；

4) 85%乙醇中浸泡5分鍾；  

5) 70%乙醇中浸泡5分鍾；

6) 蒸餾水中浸泡5分鍾；

抗原熱修複

A、高溫高壓熱修複 (酸性修複條件為(wei) 例)

取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩衝(chong) 液pH6.0於(yu) 壓力鍋中大火加熱至沸騰，將脫蠟水化後的組織芯片置於(yu) 耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩衝(chong) 液中，蓋上鍋蓋扣上壓力閥繼續加熱至噴氣，從(cong) 噴氣開始計時1-2分鍾後壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫，取出玻片，先用蒸餾水洗兩(liang) 次後，用PBS洗5分鍾。

B、微波熱修複   (酸性修複條件為(wei) 例)

取一定量的0.01M檸檬酸鹽緩衝(chong) 液pH6.0於(yu) 微波盒中微波加熱至沸騰，將脫蠟水化後的組織芯片置於(yu) 耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩衝(chong) 液中中，高檔繼續處理10-15分鍾，取出微波盒冷卻至室溫，取出玻片先用蒸餾水洗兩(liang) 次，後用PBS洗5分鍾。

酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶，使用前酶預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間為(wei) 10-30分鍾

二、免疫組化（IHC）染色

1) 脫蠟水化；

2) PBS洗3次，各6分鍾；

3) 抗原修複；

4) 用蒸餾水配置新鮮的3%H2O2-甲醇室溫封閉10分鍾；  

5) PBS洗3次，各6分鍾；

6) 滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鍾；

7) 甩去多餘(yu) 液體(ti) 滴加一抗4℃過夜；

8) 37℃複溫45分鍾；

9) PBS洗3次，各8分鍾；

10) 滴加二抗，室溫30分鍾；

11) PBS洗3次，各8分鍾；

12) DAB顯色10分鍾在顯微鏡下掌握染色程度；

13) 蒸餾水洗終止染色；

14) 蘇木素複染，鹽酸酒精分化；

15) 脫水透明封片鏡檢；