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更新時間：2023-03-21 
瀏覽次數：847Real-time qPCR如何進行數據分析
1. Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個(ge) 循環的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置於(yu) 指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對於(yu) 同一個(ge) 基因擴增一定要用同一個(ge) 閾值。
Ct值:與(yu) 起始濃度的對數成線性關(guan) 係。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(hui) 導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。2. 影響Ct值的關(guan) 鍵因素
模板濃度
模板濃度是決(jue) 定Ct的最主要因素。控製在一個(ge) 合適範圍內(nei) ，使Ct在15-35之間
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重複，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。另一個(ge) 評估PCR效率的關(guan) 鍵參數是相關(guan) 係數R2，它是說明兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 程度的統計學術語。如果R2等於(yu) 1，那麽(me) 你可以用Y值（Ct）來準確預測X值（量）。如果R2等於(yu) 0，你就不能通過Y值來預測X值。R2值大於(yu) 0.99 時，兩(liang) 個(ge) 數值之間相關(guan) 的可信度很好。
標準偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計量方法。
如果許多數據點都靠近平均值，那麽(me) 標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。實際上，足夠多重複次數產(chan) 生的數據組會(hui) 形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明，獨立同分布隨機變量在無限多時趨向於(yu) 正態分布。如果PCR反應效率是 100%，那麽(me) 2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為(wei) 1個(ge) Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標準偏差就必須小於(yu) 等於(yu) 0.167。標準偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為(wei) 了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋，標準偏差必須小於(yu) 等於(yu) 0.250
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