人外周血淋巴細胞分離液如何正確使用

人外周血淋巴細胞分離液如何正確使用

規格：200mL

保存條件：本產(chan) 品對光敏感，應該室溫避光儲(chu) 存，保質期2年。無菌開封後，保存於(yu) 室溫。

產(chan) 品簡介：

本產(chan) 品是一種用於(yu) 分離人外周血淋巴細胞的無菌、低內(nei) 毒素水平的密度梯度分離液。主要成分是Ficoll400與(yu) 泛影酸葡甲胺。適用於(yu) 從(cong) 血液分離所需細胞，在醫療和醫學生物學研究中廣泛應用。其分離原理是根據血細胞的密度差異（紅細胞和粒細胞密度為(wei) 1.090 g/mL左右；淋巴細胞和單核細胞密度為(wei) 1.075~1.090 g/mL；血小板為(wei) 1.030~1.035 g/mL），通過離心使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從(cong) 而將淋巴細胞從(cong) 人外周血或臍帶血中分離出來。

產(chan) 品指標：

密度                   1.077±0.001g/mL

滲透壓                290~350 mOsm/kg H₂O

無菌                    0.1μm 濾膜過濾

操作步驟：

•           取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可）或者去纖維蛋白血液，用等體(ti) 積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

•           在離心管中加入適量分離液（當稀釋後血液體(ti) 積小於(yu) 3mL時，加入3mL分離液；大於(yu) 等於(yu) 3mL，加入等體(ti) 積分離液。但二者的總體(ti) 積不能超過離心管的三分之二，否則會(hui) 影響分離效果），將稀釋後的血液平鋪到分離液液麵上方，注意保持兩(liang) 液麵界麵清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然後將血液小心的平鋪於(yu) 分離液上，因為(wei) 兩(liang) 者的密度差異，將形成明顯的分層界麵。如果樣品較多加樣時間較長，在離心之前出現紅細胞成團下沉屬正常現象。）

•           室溫，水平轉子500~1000g，離心20~30min（血液的體(ti) 積越大所需的離心力越大，離心時間越長，最佳的分離條件需摸索，離心轉速最大不超過1200g）。

•           離心後將出現明顯的分層：最上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與(yu) 分離液之間的白膜層即為(wei) 淋巴細胞層，離心管底部是紅細胞與(yu) 粒細胞。

•           小心的吸取白膜層細胞到15mL潔淨的離心管中，10mL PBS或細胞洗滌液洗滌白膜層細胞。250g，離心10min。

•           棄上清，5mL的PBS或細胞清洗液重懸細胞，250g，離心10min。

•           重複步驟6。

•           棄上清，細胞重懸備用。

分離純度：

使用人淋巴細胞分離液分離淋巴細胞的分離純度大於(yu) 90%。

注意事項：

•           開封前顛倒混勻，本分離液為(wei) 無菌產(chan) 品，為(wei) 延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免微生物汙染。

•           分離液使用時應始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nei) 溫度較低，可將分離液預熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心，可能會(hui) 導致白膜層中紅細胞汙染加重。

•           血液樣本最好為(wei) 新鮮抗凝血（采血2 h以內(nei) ），為(wei) 保持淋巴細胞的活性，應避免冷凍和冷藏。

•           稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含Ca、Mg離子的緩衝(chong) 液及培養(yang) 液，其成分會(hui) 導致血細胞凝集，大大降低細胞得率及純度。

•           部分塑料製品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(hui) 導致細胞掛壁，影響分離效果。

•           血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(hui) 影響分離效果，可以調節離心轉數和離心時間，摸索最佳的分離條件。

•           吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會(hui) 導致分離液交界處的粒細胞被吸出從(cong) 而使混雜的粒細胞數量增加；吸取過多的血漿層可能會(hui) 導致淋巴細胞中血漿蛋白及血小板汙染。

•           如果要進一步對分離的細胞進行培養(yang) ，那在收集血液和分離過程中，注意無菌操作，避免微生物汙染。

•    不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散係數及細胞帶電不同，用戶在製定分離液時應提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。

人外周血淋巴細胞分離液如何正確使用