明膠酶譜試劑盒現貨供應！

明膠酶譜試劑盒現貨供應！

產(chan) 品描述：

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化後能夠降解 細胞外基質的膠原蛋白，友稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與(yu) 胚胎發育、形態發生、組 織重塑等過程，並參與(yu) 炎症、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與(yu) 組織中的 MMP-2、MMP-9 參與(yu) 各種生理與(yu) 病理過程，其在研究診斷和治療中的意義(yi) 日益受到重視。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為(wei) 使用的、基 於(yu)  SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達 1 nM，高於(yu)  ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：製備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電 泳， 電泳結束後取出凝膠與(yu) 酶反應 Buffer 孵育，凝膠染色與(yu) 脫色。凝膠中由於(yu) 含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區域，從(cong) 而能同時指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩衝(chong) 液，可檢測少至 0.1~0.5 µl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進行 50 次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為(wei)  10~15個(ge) ，則總計可檢測 500~750 個(ge) 樣品。

產(chan) 品組成：

1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, 20 ºC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, 20 ºC；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。

實驗步驟（僅(jin) 供參考）

1. 製備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為(wei) 8%。按照標準程序製備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，並 90 ºC 加熱 5 分鍾。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 並使之稀釋 10 倍，混勻後加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測樣品 1:1 稀釋於(yu) 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完後可自行配製：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合後直接上樣。切勿加熱變性，並且僅(jin) 使用不加還原劑的上樣緩衝(chong) 液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染  Marker 即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與(yu) 100µl 2 × SDS-PAGE non-

reducing buffer 等體(ti) 積混合，取 5-15µl 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為(wei) 20mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nei) .可先用適量蒸餾水衝(chong) 洗凝膠，然後加入10ml

1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鍾。中間換液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低，應延長孵育時間為(wei) 10 小時或 過一夜。

6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu) ）。凝膠的大部分區域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區域。透明區域的位置和範圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現透明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀(yi) 上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景並非真正全黑。解決(jue) 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為(wei) 灰度顯示，並盡量設置為(wei) 黑色.MMP條帶則為(wei) 白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

本產(chan) 品僅(jin) 供科研實驗用，不做其它用途！