PRODUCT CLASSIFICATION
產品分類影響western blot實驗的因素你知道多少!
Western Blot實驗又稱蛋白質印跡法(免疫印跡試驗),它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳(chuan) 學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體(ti) 對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。
Western blotting是一個(ge) 步驟繁多的實驗,實驗中的每一步都會(hui) 對最後的結果產(chan) 生影響,下麵將為(wei) 你總結一些影響實驗結果的因素:
1. 樣品質量
所抽取樣品的蛋白含量,蛋白變性是否充分等等,還有,蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會(hui) 直接影響到樣品濃縮的效果。此外,蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會(hui) 對最終結果的可靠性有影響。
2.凝膠質量
不連續SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高,具體(ti) 的影響因素有:(1)分離膠的PH值應在8.8左右,而濃縮膠的PH應在6.8左右,最好不要差過0.5個(ge) PH單位,因為(wei) 這個(ge) PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件,也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此,製備凝膠的時候所用Tris-HCl緩衝(chong) 液的PH值是否穩定是很重要的。(2)用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時間,不純的丙烯酰胺會(hui) 含有丙烯酸,它會(hui) 影響到凝膠內(nei) 部局部PH環境,因此會(hui) 影響電泳的效果,沒有聚合充分的凝膠會(hui) 含有遊離的丙烯酰胺,也會(hui) 影響到局部PH環境,它們(men) 還會(hui) 與(yu) 蛋白上的氨基、巰基以及酚羥基反應影響蛋白的泳動。凝膠聚合時間以分離膠>45min,濃縮膠>20min為(wei) 宜。此外,單體(ti) 放置時間過長也會(hui) 造成丙烯酸的累積。(3)凝膠母液混合是否均勻也會(hui) 影響到凝膠濃度的分布。(4)配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會(hui) 影響到網孔的大小,因此也會(hui) 對電泳的質量有影響。(5)APS及TEMED的加入量,APS極易潮解而失去活性,因此最好是現用現配,APS不宜加入過多,否則會(hui) 氧化蛋白樣品。(6)點樣孔底部要平整。
3. 點樣
樣品盡量不要與(yu) 電泳液混合,這樣能提高濃縮的效果,因為(wei) 電泳液PH值為(wei) 8.3,而樣品為(wei) 7.5,混合後會(hui) 影響到樣品的PH值,進而影響濃縮效果。因此,建議點樣最好用長qiang頭,或者加樣器,輕輕的將樣品加到孔的底部。還有,加樣之前最好先衝(chong) 洗一下加樣孔底部,減少沒有聚合的丙烯酰胺的影響。盡量從(cong) 加樣孔的中間點樣,這樣能使得樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻,這也會(hui) 對最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過高或過低,過高會(hui) 影響條帶的形狀,過低不利於(yu) 後麵的雜交反應。
4. 電泳緩衝(chong) 液
盡量用新鮮配製的。這樣能保證PH值和離子強度的穩定。
5. 電壓條件
電壓過高,一方麵會(hui) 使凝膠溫度上升,改變凝膠內(nei) 部PH值,甚至會(hui) 造成溶膠,另一方麵,電流過大也不利於(yu) 蛋白分子的分離,容易造成條帶變形,電壓過低,又會(hui) 有樣品擴散的影響。我們(men) 經常用的濃縮時80V,分離時100V比較好,條帶很平。
6. 轉膜
先是膜的選擇,主要從(cong) 實驗目的和實驗要求來考慮。例如,要做分子量小於(yu) 20kD的小蛋白,0.45μm的NC膜是不可取的,因為(wei) 這樣可能會(hui) 使得蛋白因透過膜孔而造成膜結合的目的蛋白量不確定,從(cong) 而影響到最終結果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進行測序,則非PVDF膜不可,因為(wei) 隻有PVDF膜才能經受住嚴(yan) 酷的清洗條件。其次是轉膜方法的選擇。主要有半幹法轉膜和濕法轉膜。半幹法操作要求高,但效率也高。濕法操作要求相對低,花時間多一些。
7. 抗體(ti) 雜交與(yu) 底物顯色
一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體(ti) ,還有要注意所用的抗體(ti) 是否能夠識別變性條件下的目標蛋白;二抗一般都是效價(jia) 很高的,隻要室溫下雜交1小時就可以了,適當延長也是可以的。另外,要選擇靈敏度較高的化學反應底物。如英格恩生物的超敏型ECL發光液Enlight-Plus,檢測級別可達pg級,發光時間長,穩定。