細胞凍存液的原理及操作！

細胞凍存液的作用及操作！

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置於(yu) -196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再複蘇細胞用於(yu) 實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yang) 的細胞被汙染或其他意外事件而使細胞丟(diu) 種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買(mai) 、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養(yang) 基中加入保護劑--終濃度5%．15%的甘油或二甲基亞(ya) 碸(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內(nei) 水分透出，減少了冰晶形成，從(cong) 而避免細胞損傷(shang) 。
原理：

細胞冷凍的原理在於(yu) 盡可能降低細胞內(nei) 的晶體(ti) 形成，減少細胞內(nei) 水凝固所形成的高濃度溶質對細胞造成的低溫損傷(shang) ，從(cong) 提高細胞複蘇時的存活率。細胞凍存的數量應保證複蘇時低溫保護劑獲得1:10～1:20的稀釋，稀釋後的細胞濃度扔高於(yu) 正常傳(chuan) 代的細胞濃度為(wei) 宜，這是因為(wei) 當低溫保護劑稀釋10～20倍以後，該濃度一般不會(hui) 對細胞造成毒性損傷(shang) 。

操作步驟：

1. 配製含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yang) 液；

2. 取對數生長期的細胞，去除舊培養(yang) 液，用PBS清洗。

3. 去除PBS，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yang) 皿表麵）把單層生長的細胞消化下來；

4. 離心1000rpm，5min；

5. 去除胰蛋白酶，加入適量配製好的凍存培養(yang) 液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為(wei) 5×106/ml～1×107/ml；

6. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

7. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；

8. 凍存：標準的凍存程序為(wei) 降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然後放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nei) 。

注意事項：

1．從(cong) 增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yang) 細胞都可以用於(yu) 凍存，但最好為(wei) 對數生長期細胞。

2．將凍存管放入液氮容器或從(cong) 中取出時，要做好防護工作，以免凍傷(shang) ；

3．最好用新配製的培養(yang) 液。