信帆生物為您分享：酶聯免疫吸附實驗（ELISA）要點

信帆生物為(wei) 您分享：酶聯免疫吸附實驗（ELISA）要點

1　免疫吸附劑

　　已包被抗原或抗體(ti) 的固相載體(ti) 在低溫（2~8℃）幹燥的條件下一般可保存6個(ge) 月。有些不完整的試盒，僅(jin) 供應包被用抗原或抗體(ti) ，檢測人員需自行 包被。以下簡述固相載體(ti) 和包被過程。

2　固相載體(ti)

　　固相載體(ti) 在ELISA測定過程中作為(wei) 吸附劑和容器，不參與(yu) 化學反應。可作ELISA中載體(ti) 的材料很多，常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較 強的吸附蛋白質的性能，抗體(ti) 或蛋白質抗原吸附其上後仍保留原來的免疫學活性，加之它的價(jia) 格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為(wei) 塑料，可製成各種形式。

　　ELISA載體(ti) 的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為(wei) 常用，專(zhuan) 用於(yu) EILSA的產(chan) 品稱為(wei) ELISA板，國際上標準 的微量滴定板為(wei) 8×12的96孔式。為(wei) 便於(yu) 作少量標本的檢測，有製成8聯孔條或12聯孔條的，放入座架後，大小與(yu) 標準ELISA板相同。ELISA板的特 點是可以同時進行大量標本的檢測，並可在特製的比色計上迅速讀出結果。現在已有多種自動化儀(yi) 器用於(yu) 微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、 比色等步驟，對操作的標準化極為(wei) 有利。聚苯乙烯經射線照射後，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用於(yu) 雙抗體(ti) 夾心法可使固相上抗體(ti) 量增多，但 用於(yu) 間接法測抗體(ti) 時空白值較大。

　　良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板 由於(yu) 原料的不同和製作工藝的差別，各種產(chan) 品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。

常用的檢查方法為(wei) ：以一定濃度的人IgG（一般為(wei) 10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌後每孔內(nei) 加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體(ti) ，保 溫後洗滌，加底物顯色，終止酶反應後，分別測每孔溶液的吸光度。控製反應條件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個(ge) 讀數與(yu) 全部 讀數的均數之差，應小於(yu) 10%。

　　與(yu) 聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為(wei) ELISA固相載體(ti) ，聚氯乙烯的特點為(wei) 質軟板薄，可剪割，價(jia) 廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如 聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

　　為(wei) 比較不同固相在某一ELISA測定中的優(you) 劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個(ge) 典型的陽性標本和陰性標本，將它們(men) 進行一係 列稀釋後，在不同的固相載體(ti) 上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然後比較結果。在哪一種載體(ti) 上陽性結果與(yu) 陰性結果差別最大，這種載體(ti) 就是這一 ELISA測定項目的最合適的固相載體(ti) 。

　　在ELISA中，用作固相載體(ti) 的小珠一般為(wei) 直徑0.6cm的圓珠，表麵經磨砂處理後吸附麵積大大增加。ELISA板孔的吸附麵積約為(wei) 200mm2，小珠均為(wei) 1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附麵積的增大即意味著固相抗原或抗體(ti) 量的增加。再者，球型小珠的表麵弧度更有利於(yu) 吸 附的抗原決(jue) 定簇或抗體(ti) 結合位點的暴露麵處於(yu) 最佳反應狀態，因此珠式ELISA的反應往往更為(wei) 靈敏。小珠的另一特點是更易於(yu) 使洗滌*，使用特殊的洗滌器， 使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為(wei) 好。但由於(yu) 磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

　　小試管作為(wei) 固相載體(ti) 也有較大的吸附表麵，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為(wei) 100-200ul，而小試管可 根據需要加大反應體(ti) 積，標本反應量的增加有助於(yu) 試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最後直接放入分光光度計中比色。

　　也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料製成的微粒作為(wei) ELISA固相載體(ti) 的。其優(you) 點是表麵積極大，反應在懸液中進行，其速率與(yu) 液相反應近似。以含 鐵的磁性微粒作為(wei) ELISA固相載體(ti) ，反應後用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀(yi) 器。

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