信帆生物帶您走進免疫熒光技術

信帆生物帶您走進免疫熒光技術

上海信帆生物提供免疫熒光檢測服務，檢測周期短，技術穩定，操作細致，有需要的可以谘詢我們(men) ！

_免疫熒光

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體(ti) 技術，是標記免疫技術中發展早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體(ti) 分子與(yu) 一些示蹤物質結合，利用抗原抗體(ti) 反應進行組織或細胞內(nei) 抗原物質的定位。

技術特點：

該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完*，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較複雜。

熒光免疫法按反應體(ti) 係及定量方法不同，還可進一步分做若幹種。與(yu) 放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性汙染，並且大多操作簡便，便於(yu) 推廣。國外生物試劑的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬於(yu) 此類，並且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀(yi) 生物試劑。

由於(yu) 一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用於(yu) 定量測定有一定困難。新發展了幾種特殊的熒光免疫測定，與(yu) 酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在研究檢驗中應用。

原理：

免疫學的基本反應是抗原-抗體(ti) 反應。由於(yu) 抗原抗體(ti) 反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體(ti) 發生反應時，隻要知道其中的一個(ge) 因素，就可以查出另一個(ge) 因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體(ti) 活性的熒光色素標記在抗體(ti) （或抗原）上，與(yu) 其相應的抗原（或抗體(ti) ）結合後，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反

直接法：

將標記的特異性熒光抗體(ti) ，直接加在抗原標本上，經一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多餘(yu) 熒光抗體(ti) ，室溫下幹燥後封片、鏡檢

間接法：

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體(ti) （抗體(ti) ）與(yu) 抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體(ti) ，再用標記的抗抗體(ti) （第二抗體(ti) ）與(yu) 抗原標本反應，使之形成抗原—抗體(ti) —抗體(ti) 複合物，再用水洗去未反應的標記抗體(ti) ，幹燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體(ti) ，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為(wei) 抗體(ti) ，其它步驟的抗原檢查相同。

標記的抗抗體(ti) 是抗球蛋白抗體(ti) ，同於(yu) 血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白隻對雞的球蛋白發生反應，因此，製備標記抗體(ti) 適用於(yu) 任何抗原的診斷。

⑴熒光物質1）熒光色素許多物質都可產(chan) 生熒光現象，但並非都可用作熒光色素。隻有那些能產(chan) 生明顯的熒光並能作為(wei) 染料使用的有機化合物才能稱為(wei) 免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）為(wei) 黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於(yu) 水或酒精等溶劑。分子量為(wei) 389.4，大吸收光波長為(wei) 490--495nm，大發射光波長520--530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩(liang) 種同分異結構，其中異構體(ti) Ⅰ型在效率、穩定性、與(yu) 蛋白質結合能力等方麵都更好，在冷暗幹燥處可保存多年，是應用廣泛的熒光素。

其主要優(you) 點是：

①人眼對黃綠色較為(wei) 敏感，

②通常切片標本中的綠色熒光少於(yu) 紅色。

⑵四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為(wei) 橘紅色粉末，不溶於(yu) 水，易溶於(yu) 酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。結構式如下：大吸收光波長為(wei) 570nm，大發射光波長為(wei) 595～600nm，呈橘紅色熒光。

⑶四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結構式如下：大吸引光波長為(wei) 550nm，大發射光波長為(wei) 620nm，呈橙紅色熒光。與(yu) FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用於(yu) 雙重標記或對比染色。其異硫氰基可與(yu) 蛋白質結合，但熒光效率較低。

⑵其他熒光物質1）酶作用後產(chan) 生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。

例如4-甲基傘(san) 酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘(san) 酮，後者可發出熒光，激發光波長為(wei) 360nm，發射光波長為(wei) 450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘(san) 酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。

2）鑭係螯合物某些3價(jia) 稀土鑭係元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經激發後也可發射特征性的熒光，其中以Eu3 應用廣。Eu3螯合物的激發光波長範圍寬，發射光波長範圍窄，熒光衰變時間長，適合用於(yu) 分辨熒光免疫測定。

常見熒光：熒光素1)FITC2)RB2003)TRITC4）鑭係：Eu、Tb5)PE6）其它常見熒光素的特性

1)FITC：黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。

2)RB200：橘紅色粉末，吸收光570nm，發射光595~600nm，橘紅色熒光。

3)TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發射光620nm，橙紅色熒光。

4）鑭係：Eu、Tb

5)PE：吸收光490~560nm，發射光595nm，紅色熒光。

6）其它：酶作用後產(chan) 生熒光物質。酶作用生物質酶   底物   產(chan) 物  激發光 發射光Β-G  MUG    MU     360    450AP   MUP    MU     360    450HRP  HPA   二聚體(ti)    317    414⑷合適熒光素的選擇

1）具有與(yu) 蛋白質形成共價(jia) 鍵的化學基團。

2）熒光效率高，標記後下降不明顯。

3）熒光色澤與(yu) 背景色澤對比鮮明。

4）標記後能保持生物學活性和免疫活性

5）標記方法簡單、快速。

6）安全無毒

信帆生物帶您走進免疫熒光技術