NADH檢測試劑盒應該如何正確使用

NADH檢測試劑盒應該如何正確使用

上海信帆生物供應NADH檢測試劑盒，產(chan) 品現貨供應！

產(chan) 品簡介：
 NAD+/NADH檢測試劑盒(WST-8法) (NAD+/NADH Assay Kit with WST-8)是一種基於(yu) WST-8的顯色反應，通過比色
法來檢測細胞、組織或其它樣品中NAD+ (氧化型輔酶I)和NADH (還原型輔酶I)各自的量、比值和總量的檢測試劑盒。
 NAD+/NADH以及NADP+/NADPH的傳(chuan) 統檢測方法是檢測NADH或者NADPH在340nm處吸收波長的變化，該方法靈敏度較
低並易受樣品中有類似紫外吸收物質的幹擾，並且在紫外檢測過程中通常需要加大檢測樣品量以彌補NADH在340nm處吸
光度過小的不足，因此該傳(chuan) 統檢測方法具有很大的局限性。
 WST-8是MTT的一種升級替代產(chan) 品，和MTT或其它MTT類似產(chan) 品如XTT、MTS等相比有明顯的優(you) 點。首先，MTT被一些脫
氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chan) 生的formazan都是水溶性的，
可以省去後續的溶解步驟。其次，WST-8產(chan) 生的formazan比XTT和MTS產(chan) 生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和
MTS更加穩定，使實驗結果更加穩定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，線性範圍更寬，靈敏度更高。
 WST-8 和WST-1 相比，檢測靈敏度更高，更易溶解，並且更加穩定。
 本試劑盒使用便捷，無需分離純化細胞、組織或其它樣品中的NAD+和NADH，並且能特異性檢測NAD+和NADH，而不檢
測NADP+和NADPH。本試劑盒可以檢測含量低至0.25μM (5pmol)的NAD+或NADH，在0.25μM (5pmol)至10μM (200pmol)之
間呈現良好的線性關(guan) 係。
 NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有細胞中都存在的一種輔酶，包括NAD+ (氧化型)和
NADH (還原型)兩(liang) 種形式。NAD+既是氧化還原反應過程中傳(chuan) 遞電子的輔酶，又可以作為(wei) 很多酶的底物來參與(yu) 細胞內(nei) 反應。
例如Sirtuins家族的Sirt1等去乙酰化酶就需要以NAD+作為(wei) 底物進行去乙酰化反應來調控蛋白的乙酰化水平從(cong) 而參與(yu) 細胞的
生命活動過程。NAD+在細胞和體(ti) 內(nei) 發揮著重要的功能，其合成和降解及其產(chan) 物參與(yu) 細胞凋亡、代謝調控和基因表達的調
控等，並且NAD+的減少是細胞死亡的主要因素之一。雖然NMNAT (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase)是
NAD+的合成酶，包括Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，但NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)通常被認為(wei) 是NAD+合
成的限速酶。NAD+在調節細胞氧化還原狀態方麵的重要性以及調控信號通路及轉錄方麵的功能，使得NAD+及其合成和消
耗的酶成為(wei) 多種疾病的潛在藥物靶點。

包裝清單：
產(chan) 品編號 產(chan) 品名稱  包裝
0175-1    乙醇脫氫酶 220μl
0175-2     顯色液 1.1ml
0175-3     NADH 5mg
0175-4    NADH配製液 0.8ml
0175-5    NAD+/NADH提取液 60ml
0175-6    反應緩衝(chong) 液 10ml
— 說明書(shu) 1份
保存條件：
-20ºC保存，一年有效。顯色液(0175-2)和NADH (0175-3)須-20ºC避光保存。NADH配製成溶液後，須適當分裝後-80ºC保
存。所有試劑避免反複凍融。
注意事項：
 本試劑盒中的所有試劑均需要冷凍保存，請嚴(yan) 格按照保存條件進行保存。如果不是一次用完，為(wei) 避免反複凍融導致產(chan) 品失
效，請適當分裝後保存。
 NADH不太穩定，取出NADH後請盡快使用。如果發現標準曲線不理想，很有可能是標準品發生了降解。
 由於(yu) NAD+/NADH提取液比較粘稠，以該提取液作為(wei) 稀釋液時，無論對標準品還是樣品進行稀釋，在稀釋過程中務必保證
稀釋均勻，否則易造成實驗數據產(chan) 生較大波動。
 在樣品加樣和混勻過程中，須盡量避免產(chan) 生氣泡，以免影響終的吸光度測定。
 如果不能非常嚴(yan) 格地控製反應溫度和反應時間，每次檢測都需要設置標準曲線。
 如果樣品溶液中NAD+和NADH濃度過高或過低，不在試劑盒的線性檢測範圍內(nei) 時，可適當調整樣品或者提取液的用量。
 由於(yu) NAD+和NADH很不穩定，在凍存過程中較易降解，所以宜盡量使用新鮮樣品進行檢測。
 本產(chan) 品僅(jin) 限於(yu) 專(zhuan) 業(ye) 人員的科學研究用，不得用於(yu) 研究診斷或治療，不得用於(yu) 食品或藥品，不得存放於(yu) 普通住宅內(nei) 。
 為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品的準備：
a. 細胞樣品的準備：對於(yu) 貼壁細胞，約1×106個(ge) 細胞(大約相當於(yu) 6孔板一個(ge) 孔長滿的細胞數量)，吸淨培養(yang) 液，用移液器加
入200μl的NAD+/NADH提取液，並輕輕吹打，以促進細胞的裂解；對於(yu) 懸浮細胞，約1×106個(ge) 細胞，600g離心5分鍾，吸
淨培養(yang) 液，用移液器加入200μl冰浴預冷的NAD+/NADH提取液，並輕輕吹打，以促進細胞的裂解；裂解過程在室溫或
冰上操作均可。隨後12,000g，4ºC離心5-10分鍾，取上清作為(wei) 待測樣品備用。
b. 組織樣品的準備：冰上預冷的PBS洗滌組織後，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置於(yu) 勻漿器中，加入400μl的
NAD+/NADH提取液在室溫或冰上進行勻漿。隨後12,000g，4ºC離心5-10分鍾，取上清作為(wei) 待測樣品備用。
2. 試劑盒的準備工作：
a. NADH標準品的配製：吸取655μl NADH配製液，充分溶解本試劑盒提供的5mg NADH後即得到10mM NADH標準品。
10mM NADH標準品請適當分裝後-80ºC避光保存。
b. NADH標準曲線的設置：將10mM的NADH標準品用NAD+/NADH提取液稀釋成適當的濃度梯度，如初次檢測可以設置
0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM這幾個(ge) 濃度，檢測時96孔板中每孔加入20μl的標準品，相當於(yu) 每孔為(wei) 0、5、10、
20、40、80、120、160、200pmol的NADH。如有必要，在後續的實驗中可以根據樣品中的NADH含量對標準品的濃度
範圍進行適當調整。其中濃度為(wei) 0μM的點為(wei) 空白對照點，僅(jin) 含NAD+/NADH提取液。注意：由於(yu) NADH很不穩定，故配
製後需盡快使用。
c. 乙醇脫氫酶工作液的配製：將乙醇脫氫酶用反應緩衝(chong) 液稀釋45倍，例如2μl乙醇脫氫酶加入到88μl的反應緩衝(chong) 液中，即
可獲得90μl的乙醇脫氫酶工作液。每個(ge) 標準品或樣品的檢測需要使用90μl的乙醇脫氫酶工作液，請根據所需檢測的標準
品和樣品的數量，配製適量的乙醇脫氫酶工作液，並注意現配現用。
3. 樣品測定：
a. 樣品中NAD+和NADH的總量的測定：吸取20μl待測樣品至96孔板中，為(wei) 了減少實驗誤差建議設置樣品的重複孔。後續
如果發現樣品中的NAD+和NADH的總量過高，超出標準曲線的範圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當稀釋後
再進行檢測；總量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。
b. 樣品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的測定：吸取50-100μl待測樣品於(yu) 離心管中，60ºC水浴或PCR儀(yi) 上加
熱30分鍾以分解NAD+。如果加熱後產(chan) 生不溶物，則需10,000g，室溫或4ºC離心5分鍾，吸取20μl上清液作為(wei) 待測樣品至
96孔板中，為(wei) 了減少實驗誤差建議設置樣品的重複孔。後續如果發現樣品中的NAD+或NADH的含量過高，超出標準曲
線的範圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當稀釋後再進行檢測；含量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。
c. 請參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。加入乙醇脫氫酶工作液後充分混勻。

e. 如果希望更加精確地來表述NAD+和NADH總量或各自的含量，可以將樣品用BCA法測定蛋白濃度。終用單位蛋白量中NAD+和NADH總量或各自的含量來比較精確地進行表述。 

NADH檢測試劑盒應該如何正確使用