線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1法）的說明介紹

    本試劑盒采用JC-1一種陽離子脂質熒光染料作為(wei) 檢測線粒體(ti) 跨膜電位指示劑。JC-1有單體(ti) 和多聚體(ti) 兩(liang) 種存在狀態，在低濃度時以單體(ti) 的形式存在，高濃度時以多聚體(ti) 形式存在，兩(liang) 者的發射光譜不同，但均可在流式細胞儀(yi) 綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，JC-1可透過正常細胞膜以單體(ti) 狀態聚集胞內(nei) ，正常健康線粒體(ti) 的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴於(yu) △y的極性被迅速攝入線粒體(ti) 內(nei) ，並因濃度增高而在線粒體(ti) 內(nei) 形成多聚體(ti) ，多聚體(ti) 發射光為(wei) 紅色熒光；可被流式細胞儀(yi) 的紅色（FL-2）通道檢測到，而細胞發生凋亡時，線粒體(ti) 跨膜電位被去極化，JC-1從(cong) 線粒體(ti) 內(nei) 釋放，紅光強度減弱，以單體(ti) 的形式存在於(yu) 胞質內(nei) 發綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體(ti) 膜電位的變化。本試劑盒可應用於(yu) 細胞、組織或純化的線粒體(ti) 膜電位檢測。

操作步驟(僅(jin) 供參考)：

1、 配製JC-1染色工作液：

取適量JC-1 Stain (200×)，按照每50μl JC-1 Stain (200×)加入8ml ddH2O的比例稀釋JC-1，劇烈Vortex充分溶解並混勻JC-1。然後再加入2ml JC-1 Buffer(5×)，混勻後即為(wei) JC-1染色工作液。6孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為(wei) 1ml，其它培養(yang) 器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推。

2、 設置陽性對照：

推薦CCCP(10mM)加入到細胞培養(yang) 液中處理細胞。隨後按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體(ti) 膜電位的檢測。對於(yu) 特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guan) 文獻資料確定。

3、對於(yu) 懸浮細胞：

a. 取1～6×105細胞，重懸於(yu) 0.5ml細胞培養(yang) 液中，細胞培養(yang) 液中可以含血清和酚紅。

b. 加入0.5ml JC-1染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養(yang) 箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入4ml蒸餾水的比例，配製適量的JC-1 Buffer(1×)，並放置於(yu) 冰浴。

d. 37℃孵育結束後， 4℃ 600g離心3～4min，沉澱細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

f. 再用JC-1 Buffer(1×)重懸後，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀(yi) 分析。

4、對於(yu) 貼壁細胞：

注意：對於(yu) 貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀(yi) 檢測，應先收集細胞，重懸後參考懸浮細胞的檢測方法。

a.吸除6孔板培養(yang) 液，根據具體(ti) 實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1ml細胞培養(yang) 液。細胞培養(yang) 液中可以含有血清和酚紅。

b. 加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yang) 箱中37℃孵育。

c. 在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配製適量的JC-1 Buffer(1×)，並放置於(yu) 冰浴。

d. 37℃孵育結束後， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。

e. 加入2ml細胞培養(yang) 液，培養(yang) 液中可以含有血清和酚紅。

f. 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對於(yu) 純化的線粒體(ti) ：

a. 把配製好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。

b. 0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為(wei) 10～100μg純化的線粒體(ti) 。

c. 用熒光分光光度計或熒光酶標儀(yi) 檢測：混勻後直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發波長為(wei) 485nm，發射波長為(wei) 590nm。如果使用熒光酶標儀(yi) ，激發波長不能設置為(wei) 485nm時，可以在475～520nm範圍內(nei) 設置激發波長。另外，也可以參考下麵步驟6中的波長設置進行熒光檢測。

d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下麵的步驟6。

6、熒光觀測和結果分析：

檢測JC-1單體(ti) 時可以把激發光設置為(wei) 490nm，發射光設置為(wei) 530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發光設置為(wei) 525nm，發射光設置為(wei) 590nm。出現紅色熒光說明線粒體(ti) 膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項
1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(hui) 凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nei) ，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解後使用。

2，請勿把JC-1染色緩衝(chong) 液（5×）全部配製成JC-1染色緩衝(chong) 液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩衝(chong) 液（5×）。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉澱，必須全部溶解後才能使用，為(wei) 促進溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完並洗滌後盡量在30分鍾內(nei) 完成後續檢測。在檢測前需冰浴保存。

4，應避免反複凍融。不可先配製JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否則導致JC-1很難充分溶解，嚴(yan) 重影響後續的檢測。可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解後使用.

5，裝載完JC-1後用JC-1 Buffer(1×)洗滌時，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。

6，CCCP為(wei) 線粒體(ti) 電子傳(chuan) 遞鏈抑製劑，有毒，請注意小心防護。

 7，為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。