蛋白實驗中常見的問題

1、蛋白樣品不能反複凍融；

2、蛋白樣品應加蛋白酶抑製劑，以增加蛋白的穩定性；

3、細胞水平要做 Western Blot，一般地 5×10⁶ 個(ge) 細胞提取的蛋白夠就足 Western Blot；

4、如果目標蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，建議提取後hao加上 NaF 去抑製磷酸化酶的活性；

5、若轉膜不*，可以加大上樣量，還有轉移時你可以用降低電流延長時間，轉膜液中甲醇的比例多加 5－10％；

6、如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載 30％是不會(hui) 有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm 的 comb；

7、蛋白變性後，－80℃，一兩(liang) 年沒有問題。關(guan) 鍵兩(liang) 條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)；

8、脫脂奶粉中含生物素，如果實驗中有涉及到“生物素”請將封閉液改為(wei) BSA 封閉；

9、做 200kd 以上蛋白的 Western Blot 時要注意，分離膠hao選擇>7%的；剝膠時要小心；轉移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現雜帶不知道如何分析）；

10、蛋白的上樣量要根據實驗的要求來定，如果要求是定量和半定量的 Western Blot 則上樣量要均等，如果隻是要定性，則沒有太大的關(guan) 係，盡量多上就行了，但是不要超過 0.3μg/mm2；

11、一抗，二抗的比例是比較重要，調整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底；

12、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體(ti) 嗎？

免疫組化時抗體(ti) 識別的是未經變性處理的抗原決(jue) 定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬於(yu) 構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮後的蛋白都含有；構象型表位由於(yu) 受蛋白空間結構限製，煮後變性會(hui) 消失。如果你所用的抗體(ti) 識別的是蛋白上連續的幾個(ge) 氨基酸，也就是線性表位，那麽(me) 這種抗體(ti) 可同時用於(yu) 免疫組化和 Western，而如果抗體(ti) 識別構象形表位，則隻能用於(yu) 免疫組化。一般抗體(ti) 說明書(shu) 上都有注明此種抗體(ti) 識別的氨基酸區間。（限於(yu) 單抗）；

13、抗體(ti) 工作溶液一般不主張儲(chu) 存反複使用，但是如抗體(ti) 比較珍貴，可反複使用 2－3 次。稀釋後應在 2－3 天內(nei) 使用，4 度保存，避免反複凍融；

14、NC 膜 PVDF 膜 尼龍膜的差異。

尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用zui廣的一種固相支持物，價(jia) 格*；PVDF 膜介於(yu) 二者之間。

就結合能力而言： 尼龍膜結合 DNA 和 RNA 能力可達 480－600μg/cm²，可結合短至 10bp 的核酸片段；硝酸纖維素膜結合 DNA 和 RNA 能力可達 80－100μg/cm²，對於(yu) 200bp 的核酸片段結合能力不強；PVDF 膜結合 DNA 和 RNA 能力可達 125－300μg/cm²。

就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射後，核酸中的部分嘧啶堿基可與(yu) 膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合 DNA，結合不牢固；PVDF 膜結合牢固，耐高溫，特別適合於(yu) 蛋白印跡。

就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF 膜較強。

就重複性而言：尼龍膜可反複用於(yu) 分子雜交，雜交後，探針分子可經堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重複使用；PVDF 膜可以重複使用。

15、在做 Western Blot 時，PVDF 膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF 膜用甲醇泡的目的是為(wei) 了活化 PVDF 膜上麵的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個(ge) 目的。

16、膜、濾紙、膠大小有何講究？

如果用的是半幹法，順序為(wei) ：陰極－濾紙－膠－膜－濾紙。濾紙的長寬分別比膠麵小 1－2mm，而膜的長寬分別比膠大 1－2mm。

禁忌：上下兩(liang) 層濾紙因為(wei) 過大而相互接觸，這樣會(hui) 短路，電流不會(hui) 通過膠和濾紙。

17、電泳時 Marker 總跑不全所有條帶，即使用增大膠濃度仍不全？

檢查兩(liang) 種緩衝(chong) 液 Tris-HCl（pH 8.8 和 pH 6.8），有可能有長菌現現象，建議重配兩(liang) 種緩衝(chong) 液。

18、Western Blot 染色的選擇

（1）陰離子染料是zui常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到 1.5μg，考馬斯亮藍雖然與(yu) 氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗(li) 春紅 S 和快綠在檢測後容易從(cong) 蛋白質中除去 ，以便進行隨後的氨基酸分析。

缺點是：溶劑係統的甲醇會(hui) 引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用於(yu) 正電荷的膜。靈敏度低。

（2）膠體(ti) 金，靈敏度高，檢測範圍可到 pg 級，但染色不穩定。

（3）生物素化靈敏度位於(yu) 1、2 之間，可用於(yu) 任何一種膜。

19、轉膜液加甲醇的目的是什麽(me) ？

加甲醇起著一定的固定作用，因為(wei) 小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因為(wei) NC 膜結合蛋白質的能力較弱)。

20、轉膜時何為(wei) 濕法，何為(wei) 半幹法？

半幹法和濕法轉移是兩(liang) 種不同的轉移裝置下的轉移係統，將膜，膠，濾紙整個(ge) 浸泡在 buffer 的 Tank 裏轉移的，叫濕法；用濾紙吸 buffer 來做轉移體(ti) 係的叫半幹法。

21、為(wei) 什麽(me) 濃縮膠和分離膠的電壓不一致？同樣的電壓可以嗎？

濃縮膠的目的使得 loading 的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在後麵的蛋白趕上來前進入分離膠。

而在分離的理論上（實際上也是）小電壓長時間分離的效果會(hui) 更好，但是在操作過程中沒有必要等那麽(me) 長的時間，所以就用大電壓快點跑。