DEAE-纖維素DE-32，Cellulose DE-32

DEAE-纖維素DE-32，Cellulose DE-32

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DEAE-纖維素，它采用平均粒徑為(wei) 50µm的顆粒型親(qin) 水高分子聚合物，表麵又用大分子糖鏈接枝，使它有更高的比表麵積和更好的生物兼容性，保持更高載量，同時又具有更好的分辨率。由於(yu) 比表麵積大，平衡和洗脫的時間也更短。它經過接枝即使是純化病毒，質粒等超大分子的物質，載量基本保持不變。

DEAE—離子交換劑純化血清IgG使用步驟及注意事項

 DEAE-纖維素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纖維素上引入二乙基氨基乙基，屬於(yu) 弱堿型陰離子交換劑。吸附蛋白質的適pH範圍為(wei) 7～9，pH超過9.5，DEAE基團則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解離基團，與(yu) 蛋白質的交換量可75-122mg/100mgDEAE。

    應用離子交換劑來純化物質，可以是把要純化的物質成分交換吸附於(yu) 離子交換劑上，然後再分別洗脫下來獲得純品，或者把不需要的成分吸附於(yu) 離子交換劑上，需要的成分直接流出，得到純品。本實驗采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG，利用pH6.7的緩衝(chong) 液溶解樣品IgG，此時IgG粗物中除IgG外，其他雜蛋白均帶上不同數量的負電荷，可以和DEAE上的陰離子發生交換吸附於(yu) 柱上。IgG因不解離帶電，而不發生交換吸附，利用此特點，讓溶解後的樣品流過DEAE纖維素柱，即可直接收集到較純的IgG。

  （一）試劑及器材

    1.   0.0175mol/L， pH6.7，磷酸鹽緩衝(chong) 溶液

    2.   奈氏試劑。

    3.   20%（W/V）磺基水楊酸溶液。

    4.   1cm×50cm

    5.   黑、白比色磁盤。

    （二）操作步驟

    1．活化

    根據所需層析柱的柱床體(ti) 積計算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過夜，其間換幾次水，每次除去細小顆粒。抽幹，改用0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽幹（可用布氏漏鬥），用無離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無離子水洗至pH6左右。然後用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩衝(chong) 液，浸泡平衡後使用。

    2．裝柱

    用0.0175mol/L，pH6.7，磷酸鹽緩衝(chong) 溶液浸泡已處理好的DEAE-纖維素，並更換1～2次。然後攪拌均勻，灌入層析柱中，直至纖維素柱床高約17cm左右為(wei) 止。柱床形成後，在洗脫瓶裝入0.0175mol/L pH6.7磷酸鹽緩衝(chong) 溶液，接在層析柱上口，打開柱下端出口，使磷酸鹽緩衝(chong) 溶液流過纖維素，直至流出液的pH值與(yu) 磷酸鹽緩衝(chong) 溶液的pH值*相同（用pH試紙不斷檢查）為(wei) 止。

    3．上樣 

    上述平衡過程完畢後，關(guan) 閉柱下口。用滴管吸去纖維素柱麵上的深液（但不能低於(yu) 柱下口），控製流速使樣品慢慢進入纖維素內(nei) 。待全部樣品進入柱後，在柱床麵上加一層0.0175mol/L  pH6.7 磷酸鹽緩衝(chong) 溶液。

    4．洗脫

    連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫。控製流速為(wei) 0.5ml/min， 用試管收集洗脫液，每管10滴。從(cong) 每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盤孔中，加入1滴20%磺基水楊酸檢查是否產(chan) 生白色沉澱。在此條件下在收集液中首先出現的蛋白質即為(wei) 純化的IgG。因此，從(cong) 洗脫開始就應收集洗脫液，直至收集液中無蛋白質出現為(wei) 止（加磺酰水楊酸不呈白色沉澱），合並含有蛋白質的各管收集液中無蛋白質即為(wei) 純化的IgG溶液。

    5．再生 

    用過的離子交換劑可以反複使用，使其恢複原狀的方法俗稱“再生”。 由於(yu) DEAE-纖維素使用後因帶有大量雜蛋白，所以再生時，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用無離子洗至pH8左右，然後用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩衝(chong) 溶液浸泡即可轉型再使用。

    6．鑒定 

    純化後獲得的蛋白質樣品均應進行鑒定後方能證明產(chan) 品的合格性。

DEAE-纖維素DE-32，Cellulose DE-32