明膠酶譜法電泳試劑盒

明膠酶譜法電泳試劑盒

1. 簡介：
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化後能夠降解細胞外基質的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質，膠原酶參與(yu) 胚胎發育、形態發生、組織重塑等過程，並參與(yu) 炎症、腫瘤、心血管、神經等許多疾病過程。血漿與(yu) 組織中的MMP-2、MMP-9參與(yu) 各種生理與(yu) 病理過程，其在研究診斷和治療中的意義(yi) 日益受到重視。
 
2. 檢測原理：
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為(wei) 使用的、基於(yu) SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高於(yu) ELISA方法，其基本原理和程序是：製備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束後取出凝膠與(yu) 酶反應Buffer 孵育，凝膠染色與(yu) 脫色。凝膠中由於(yu) 含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從(cong) 而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應緩衝(chong) 液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為(wei) 10~15個(ge) ，則總計可檢測500~750個(ge) 樣品。
 
3. 檢測目的:
本試劑盒用於(yu) 檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。
 
4.  試劑盒組成與(yu) 儲(chu) 存：
A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；
B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC；
C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；
D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；
E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。
 
5.檢測步驟：
5.1 製備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為(wei) 8%。按照標準程序製備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，並90 ºC 加熱5分鍾。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 並使之稀釋10倍，混勻後加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
5.2 待測樣品1:1 稀釋於(yu) 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完後可自行配製：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合後直接上樣。切勿加熱變性，並且僅(jin) 使用不加還原劑的上樣緩衝(chong) 液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。
陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與(yu) 100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體(ti) 積混合，取5-15μl 上樣。
注：因為(wei) 全血成分複雜,MMP活性較低，好的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照
5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為(wei) 20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。
5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nei) 。可先用適量蒸餾水衝(chong) 洗凝膠，然後加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鍾。中間換液。
5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為(wei) 10小時或過夜。
5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見後麵所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu) ）。凝膠的大部分區域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。
透明區域的位置和範圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。
5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀(yi) 上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景並非真正全黑。解決(jue) 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為(wei) 灰度顯示，並盡量設置為(wei) 黑色。MMP 條帶則為(wei) 白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式。

注意事項：
1.製備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。
2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩衝(chong) 液配製應嚴(yan) 格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH在7.5-7.6，複性的TRITON時間長了會(hui) 有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培養(yang) 箱中，因為(wei) 會(hui) 改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明膠要4度保存，配好後1周內(nei) 使用

凝膠製備：
1.玻璃板對齊後放入夾中，垂直卡緊，加滿水檢漏。
2.配10%分離膠，APS和TEMED作用為(wei) 促凝，後灌膠前加。若板不漏水，則將水倒出，並用吸水紙洗淨後灌膠，灌至大約3/4處，上麵加滿水壓平。
3.配濃縮膠，同樣地，APS和TEMED後加，分離膠灌入約30min後觀察小燒杯中剩餘(yu) 分離膠是否已凝，同時仔細觀察可見玻板水和膠間有一條折線，說明膠已凝固。
4.將上麵的水倒去，吸水紙洗淨，灌入濃縮膠，灌滿，注意一定不要有氣泡，然後將梳子插入，注意保持水平，約30min後凝固可用。
5.拔梳子在電泳緩衝(chong) 液中拔，加樣孔用小針筒衝(chong) 洗幹淨再上樣，注意上樣時勿使樣品逸至鄰孔，樣品混勻時要輕，不要產(chan) 生氣泡，否則加樣時易導致逸出而使結果不準確。

明膠酶譜法電泳試劑盒