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實驗原理

    用於(yu) 免疫酶技術的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰膽堿酯酶，6－磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用於(yu) ELISA法的酶有辣根過氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為(wei) 多。由於(yu) 酶摧化的是氧化還原反應，在呈色後須立刻測定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準確地定量。

     辣根過氧化物酶（HRP）是一種糖蛋白，每個(ge) 分子含有一個(ge) 氯化血紅素（protonhemin）區作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量表示。氯化血紅素輔基的zui大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的zui大吸收峰是275nm，所以酶的濃度和純度計算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分濃度為(wei) 100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶濃度以 mg/ml 計算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm純度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大說明酶內(nei) 所含雜質越少。高純度HRP的RZ值在3.0左右，zui高可達3.4。用於(yu) ELISA檢測的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三條：

    （1）抗原或抗體(ti) 能以物理性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 表麵，可能是蛋白和聚苯乙烯表麵間的疏水性部分相互吸附，並保持其免疫學活性；
    （2）抗原或抗體(ti) 可通過共價(jia) 鍵與(yu) 酶連接形成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫學和酶學活性；
    （3）酶結合物與(yu) 相應抗原或抗體(ti) 結合後，可根據加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在，而且顏色反應的深淺是與(yu) 標本中相應抗原或抗體(ti) 的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗結果。

    ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用於(yu) 多種病原微生物所引起的傳(chuan) 染病、寄生蟲病及非傳(chuan) 染病等方麵的免疫診斷。也已應用於(yu) 大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為(wei) ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易於(yu) 自動化操作等特點。不僅(jin) 適用於(yu) 研究標本的檢查，而且由於(yu) 一天之內(nei) 可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合於(yu) 血清流行病學調查。本法不僅(jin) 可以用來測定抗體(ti) ，而且也可用於(yu) 測定體(ti) 液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用範圍日益擴大，可概括四個(ge) 方麵： 1、免疫酶染色各種細胞內(nei) 成份的定位。 2、研究抗酶抗體(ti) 的合成。 3、顯現微量的免疫沉澱反應。 4、定量檢測體(ti) 液中抗原或抗體(ti) 成份。

基本方法一　用於(yu) 檢測未知抗原的雙抗體(ti) 夾心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝(chong) 液將抗體(ti) 稀釋至蛋白質含量為(wei) 1～10μg／ml。在每個(ge) 聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過一夜。次日，棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗3次，每次3分鍾。（簡稱洗滌，下同）。
　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
　　3.　加酶標抗體(ti) ：於(yu) 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(ti) （經滴定後的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
　　4.　加底物液顯色：於(yu) 各反應孔中加入臨(lin) 時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。
　　5.　終止反應：於(yu) 各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　結果判定：可於(yu) 白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nei) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為(wei) 無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀(yi) 上，於(yu) 450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於(yu) 規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為(wei) 陽性。

基本方法二　用於(yu) 檢測未知抗體(ti) 的間接法：
用包被緩衝(chong) 液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過一夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體(ti) ）0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）
↓
於(yu) 反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(ti) （抗抗體(ti) ）0.1ml，37℃孵育30-60分鍾，洗滌,zui後一遍用DDW洗滌。
↓
其餘(yu) 步驟同“雙抗體(ti) 夾心法”的4、5、6。

（二）酶與(yu) 底物

    酶結合物是酶與(yu) 抗體(ti) 或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產(chan) 物。是ELISA成敗的關(guan) 鍵試劑，它不僅(jin) 具有抗體(ti) 抗原特異的免疫反應，還具有酶促反應，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。

免疫技術常用的酶及其底物 

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