elisa試劑盒和生化試劑盒該如何選擇和評判

   隨著電子檢驗儀(yi) 器的研製和普遍使用，推動了科研診斷試劑研究和使用廣泛化的進程，商品試劑與(yu) 標準液按檢測項目組合成一套放在一個(ge) 包裝盒內(nei) 叫試劑盒（reagent kit），或叫試劑組合（reagent set）。

   與(yu) 自動化分析儀(yi) 或者酶標儀(yi) 匹配的試劑盒的研製、生物試劑和供應走向產(chan) 業(ye) 化的道路，它無疑是科研檢驗發展*一個(ge) 巨大的技術進步。但是，試劑盒的質量，將嚴(yan) 重影響測定結果的正確性。為(wei) 了增強識別試劑質量的能力，提高拒用劣質試劑的自覺性，掌握有關(guan) 試劑盒的質量標準和質量評價(jia) 是十分有益的。

   我們(men) 先來說說和自動生化分析儀(yi) 想匹配的生化分析試劑盒的相關(guan) 情況。此類試劑種類繁多，有液體(ti) 型、粉劑型、片劑型，有單一試劑、雙試劑、幹試劑、多試劑等。

一、液體(ti) 型試劑和粉（片）劑型試劑

（一）液體(ti) 型試劑

無論是單試劑還是雙試劑型試劑，目前乃至今後仍以液體(ti) 型為(wei) 主要劑型。其優(you) 點是液體(ti) 型試劑

的試劑組分高度均一，瓶間差異小，測定重複性好和使用方便；它也無需加入任何輔助試劑及蒸餾

水，避免了外源性水質對試劑的影響，性能較穩定，測定結果較為(wei) 準確。缺點是液體(ti) 型試劑（尤其

是酶試劑）保存時間較短，不便於(yu) 運輸。

1．液體(ti) 單試劑        

所謂液體(ti) 單試劑就是將某種生化檢驗項目所用到的試劑科學地混合在一起，

組成為(wei) 一種試劑。應用時，隻須將標本和試劑按一定比例混合，即可進行相應的生化反應，然後用

適當的方法檢測結果。應用十分方便。為(wei) 了簡化測定操作程序，提高工作效率，一度大多數試劑廠

家都生物試劑單試劑，以滿足用戶的需要。如測定葡萄糖和膽固醇的酶法試劑等。這些試劑的廣泛使用，

充分顯示出酶法試劑無毒性、操作簡便快速、測定結果可靠等優(you) 點。但對有些生化檢驗項目來說，

單試劑存在抗幹擾能力差的缺點，給測定結果帶來相當大的分析誤差。例如，甘油三酯測定的一步

法試劑，由於(yu) 未消除樣品中的遊離甘油，使測定結果中包括了內(nei) 源性甘油（平均約為(wei)  0.11mmol/L），會(hui) 給甘油三酯的測定值帶來較大的誤差。類似的情況還見於(yu) 維生素C和尿酸及膽紅素對Trinder+選用時值得注意。

2．液體(ti) 雙試劑       所謂液體(ti) 雙試劑就是將某些生化檢測項目所用到的試劑，按用途科學地分成兩(liang) 類，分別配成兩(liang) 種試劑，通常試劑加入後可起到全部或部分消除某些內(nei) 源性幹擾的作用，第二試劑為(wei) 啟動被檢測物質反應的試劑，兩(liang) 種試劑混合後才共同完成被檢項目的生化反應。然後用適當的方法檢測結果。雙試劑型試劑盒，它保持了單試劑的優(you) 點，增強了抗幹擾能力和試劑的穩定性，提高了測定的準確性，代表了診斷試劑盒劑型研製的主要發展方向。

（二）粉（片）劑型試劑

所謂粉劑型及片劑型試劑，即是將試劑的各組分用球磨技術粉碎成粉劑或混合後壓成片劑，使

用前再加入的溶液複溶成液體(ti) 試劑。幹粉試劑如果在凍幹分裝前是液體(ti) 型的，則其各組分是相

當均勻的；但如果用固體(ti) 原料研磨後製成粉劑或片劑，則存在許多問題：①要使試劑各組分混合得

非常均勻，技術難度很大；②分裝過程中的稱量誤差及複溶時加水量的準確性影響試劑的瓶間差；

③水質優(you) 劣對試劑的穩定性和測定的可靠性有相當大的影響。

二、其它類型試劑

為(wei) 了適應生化分析儀(yi) 和測定方法學的進步，近年來研究了許多新型的試劑盒，主要有以下幾種。

（一）快速反應試劑盒

快速反應試劑盒主要是為(wei) 了適應生化分析的技術進步，縮短反應時間，提高工作效率。如血液

葡萄糖快速測定試劑盒。其試劑成分及濃度為(wei) 磷酸鹽緩衝(chong) 液  100mmol/  L，pH7.4±0.1，葡萄糖氧

化酶  > 40u / ml，變旋酶  > 0.2u / ml，過氧化物酶  > 2.5u / ml，4-氨基安替比林 0.5 mmol/ L，

4-羥基苯甲酸 4  mmol/L，亞(ya) 鐵qing化鉀 1mg  /  L，疊氮鈉 0.4g  /  L。同一般葡萄糖氧化酶法試劑相

比是明顯增加了葡萄糖氧化酶及過氧化物酶用量，更主要是增加了變旋酶，可使反應加快，3～4

分鍾後即生成終顏色。再如快速膽固醇試劑盒，用的是 pH6.6±0.2，250mmol/ L 磷酸鹽緩衝(chong) 液，

膽固醇酯酶為(wei)  250u / L，膽固醇氧化酶 250 u/L，過氧化物酶 4000u / L，4-氨基安替比林 0.3mg /

L，DHBS      8mmol/  L。樣品與(yu) 試劑比例是 1:100。37℃反應 2 分鍾即可完成反應。可以明顯看出是

加大膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶等效應酶用量，從(cong) 而使反應加速。目前要求這種快速反應的試劑用

戶還不多，但它是一種發展趨勢。

（二）一步法試劑盒

這是隨著方法學的改進，特別是免疫技術的進步，利用特異性抗體(ti) 參與(yu) 反應的新型試劑。如高

密度脂蛋白（HDL）測定。以往多采用超速離心法和沉澱法使 HDL 從(cong) 其他脂蛋白中分離後再測定 HDL中膽固醇，沉澱法操作繁瑣，必須預先處理才能用生化分析儀(yi) 分析。近年來采用抗低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白血清預先抑製 LDL 及 VLDL，然後再測定 HDL，這樣就減少沉澱預處理，直接測定出高密度膽固醇。類似的試劑盒還有肌酸激酶（CK）及其同工酶 CK-MB 的測定。

（三）多項同測組合試劑盒

這類型試劑主要是用於(yu) 三點雙項同測終點法、三點雙項同測連續監測法和三點雙項同測終點速

率法測定的試劑盒。很明顯這類試劑同以往單試劑和雙試劑有明顯不同。隨著雙試劑的應用，研究

生化分析儀(yi) 的分析方法也相應發展，其中有一種分析方法是在同一比色杯中，先後加入兩(liang) 種試劑與(yu)

檢品中的兩(liang) 種被檢物發生反應，在各反應達到平衡期時分別測定，整個(ge) 測定過程進行三次比色，測

定兩(liang) 個(ge) 項目，稱為(wei) 三點雙項同測終點法。例如甘油三脂、膽固醇同時測定法。該法的試劑為(wei)

Tris 緩衝(chong) 液，含膽固醇酯酶、ATP、MgCl2、過氧化物酶、磷酸甘油氧化酶、甘油激酶、脂肪酶、4-

氨基安替吡啉、2-羥 3.5-氯苯磺酸鈉、Triton-X 等，第二試劑為(wei)  Tris 緩衝(chong) 液，其中含膽固醇氧化酶。當血清或標準液（包括甘油三酯和膽固醇）與(yu) 試劑混合後立即進行次比色（510nm）

得空白吸光度。37℃作用 5 分鍾後進行第二次比色，為(wei) 甘油三酯與(yu) 酶試劑反應終點的吸光度，又是

膽固醇測定的空白吸光度。然後加入第二試劑，37℃作用 5～10 分鍾，進行第三次比色，為(wei) 膽固醇

與(yu) 酶試劑反應終點的吸光度。

甘油三酯濃度=[A2（樣品）-AB（樣品）]/[A2（TG  標準）-AB（TG  標準）]×甘油三酯標準的濃度

總膽固醇濃度=[A3（樣品）-A2（樣品）]/[A3（TC  標準）-A2（TC  標準）]×膽固醇標準的濃度

（四）卡式試劑盒

試劑首先裝入試劑瓶，瓶上充分使用編碼技術，而後根據編碼啟動調配、使用及更換儲(chu) 存。其

特點是：①卡式試劑瓶上條碼令使用者可快捷準確地輸入試劑數據，如測試數量、批號、有效期，

保證正確識別試劑。②試劑裝載後能自動調配，可消除潛在誤差，並節省操作時間。③持續不斷地

監察儀(yi) 器上已裝載的試劑存量，並在供應量不足時通知使用者。試劑裝載使用時間可長達一個(ge) 月。

④所有卡式試劑盒大小劃一，有利儲(chu) 存。卡式試劑設計較*，可防止試劑蒸發及降解，能確保試

劑裝載後的穩定性更長，從(cong) 而節省成本。⑤標簽根據測試類別以顏色編碼，便於(yu) 使用者識別。

（五）濃縮試劑盒

上述卡式試劑盒就是采用的濃縮試劑，使用時自動完成稀釋，而後用於(yu) 測定。濃縮試劑便於(yu) 工

作、儲(chu) 存、運輸、裝載等*性是很明顯的，濃縮試劑便於(yu) 監控、減少校正次數、提高工作質量。

在濃縮試劑基礎上又組成雙試劑及多項同測組合試劑，又體(ti) 現出它們(men) 所具有的特點及*性。

三、液體(ti) 雙試劑盒的特點

液體(ti) 雙試劑與(yu) 其它類型試劑比較具有液體(ti) 試劑和雙試劑的優(you) 點。

（一）提高了抗幹擾反應的能力

在研究生化測定過程中，血標本除了含有待測物質外，還含有各種酶、有機物、無機鹽等物質，

這些物質都會(hui) 幹擾或參與(yu) 測試反應，引起非特異性反應幹擾，而雙試劑型試劑盒設計的一個(ge) 主要目

的就是為(wei) 了克服這種幹擾反應。在測定過程中，首先讓試劑Ⅰ與(yu) 標本中的幹擾物質反應，反應  5

分鍾後，再用試劑Ⅱ啟動真正的測試反應，從(cong) 而使測定結果更加準確。

例如：尿素氮的酶法測定。此測定通過二步化學反應來完成。

在 340nm 下監測吸光度值的變化，與(yu) 同樣處理的尿素標準液比較，計算出樣品尿素含量。這

一反應的步特異性高，脲酶隻對樣品中的尿素起催化作用，但第二步反應就存在一些幹擾：樣

品中（如血清、尿液）含有 NH4，（內(nei) 源性 NH4）會(hui) 消耗 NADH，使測定結果偏高；複溶試劑時所

用蒸餾水如果含有 NH4 或者所用器材不夠清潔被 NH4 汙染（外源性 NH4）也會(hui) 消耗 NADH，使測

定結果偏高；當樣品中（如血清）含有較高的丙酮酸時，血清中的乳酸脫氫酶會(hui) 催化下列反應：

LDH

單一試劑型試劑測定尿素時存在內(nei) 源性 NH4、外源性 NH4 和內(nei) 源性丙酮酸的幹擾，使測定結果產(chan)

生正誤差。

測定尿素的酶法雙試劑（液體(ti) 型）試劑盒有兩(liang) 個(ge) 試劑，均為(wei) 液體(ti) ，不必複溶。試劑含α—

酮戊二酸、NADH、穀氨酸脫氫酶及維持 pH 的緩衝(chong) 物質。第二試劑含脲酶、NADH、α—酮戊二

酸。當被檢樣品加入試劑在 37℃作用 5 分鍾，將內(nei) 源 NH4、外源性 NH4 及內(nei) 源性丙酮酸消耗 。 接 著 加 入 第 二 試 劑 使 樣 品 中 的 尿 素 被 脲 酶 水 解 成   NH4 ， 再 進 行 第 二 步 反 應 ，

GLDH

了尿素測定的準確性。

再如：目前在研究化學檢測中用的較為(wei) 普遍的指示反應 Trinder 反應（主要用於(yu) 代謝產(chan) 物的測

定，如葡萄糖、尿酸、甘油三脂、膽固醇、HDL），此指示反應的特異性較差，受到血標本中的膽

紅素、抗壞血酸的幹擾，導致結果的陰性偏差。其中為(wei) 了克服膽紅素的幹擾，國內(nei) 外部分試劑已通

過加入鐵qing化鉀、調整顯色劑改變測定波長來排除膽紅素的幹擾，而抗壞血酸的影響和幹擾一直較

難克服，從(cong) 麵影響了測定結果。液體(ti) 雙試劑（包括甘油三脂、膽固醇、HDL、尿酸、肌酐）在試

劑 I 中加入了抗壞血酸氧化酶，當標本和試劑 I 先反應，便可克服標本抗壞血酸的幹擾，當抗幹擾

反應完畢後，再加入試劑Ⅱ啟動反應，從(cong) 而使得整個(ge) 反應的特異性大大提高，準確度也相應提高。

另外，常見的幹擾是黃疸。有的測定試劑中加有膽紅素氧化酶，先作用黃疸血清使其氧化無

色，而後再加反應試劑完成反應測定，消除黃疸的影響。

（二）使測定更科學合理

由於(yu) 液體(ti) 雙試劑的使用，使測定更加科學合理。如

LP

GK

GPO

POD

目前國內(nei) 研究生化檢驗使用的生化試劑絕大多數都是單一試劑，在甘油三脂測定中測得甘油三

脂的含量實際上是標本中甘油三脂與(yu) 遊離甘油的總含量，盡管研究上可以通過減去標本中平均遊離

甘油的含量和修改正常範圍加以彌補，但是，由於(yu) 研究標本的個(ge) 體(ti) 差異，使得血標本中遊離甘油的

含量不可能都一樣。而液體(ti) 雙試劑可先讓標本與(yu) 試劑 I 反應（試劑 I 中包括甘油激酶、抗壞血酸氧

化酶、甘油—3—磷酸氧化酶、過氧化物酶），從(cong) 而*消耗標本中遊離甘油，排除抗壞血酸的幹擾，

然後再用試劑Ⅱ含有 LP 和發色團啟動反應，使得測得的結果真正反映標本中甘油三脂的含量。

（三）穩定性能優(you) 良

目前研究化學檢定的許多項目都已用酶法進行測定，這些酶法測定與(yu) 以往化學測定法相比具有

*的*性：①特異性高；②試劑單一，操作步驟簡單，可自動操作；③反應溫和，無汙染

等。但是酶法生化商品試劑生物試劑的大技術障礙便是試劑的穩定性問題，為(wei) 此許多試劑生物試劑廠家推

出了凍幹、幹粉、片劑的酶法試劑，從(cong) 而解決(jue) 了成品貯存與(yu) 運輸問題，然而在使用過程中仍然受到

了複溶後穩定性的影響，各實驗室在使用中如果包裝太大，複溶後穩定期過後便會(hui) 造成浪費，如果

包裝太小，本身價(jia) 格太高，造成日常化驗成本居高不下。全液體(ti) 酶法試劑從(cong) 分配上解決(jue) 了這一矛盾：

①用戶可根據每次標本量多少按一定比例配製適量工作液，當天配製當天用完，這樣便可減少試劑

損失。②如果用戶使用的自動生化分析儀(yi) 有雙試劑測定功能，那麽(me) ，就不必把雙試劑混合成工作試

劑進行測定，試劑的有效期一年便是工作液的有效期。

對於(yu) 幹粉、片劑型等需複溶的生化試劑，水質的好與(yu) 壞直接影響了複溶後工作液的穩定性和測

定重複性。目前除了一些大城市的三級醫院有自製的試劑級的蒸餾水外，別的醫院很難獲得符合試

劑級要求的水，這就對幹粉、片劑試劑的實際使用造成了一定影響。目前研究化學檢測中許多項目

已經開始用酶法進行分析測定，而試劑中許多酶在水溶液中是比較“脆弱”的，許多雜質都會(hui) 影響

酶活力，如①水中  F  會(hui) 引起某些酶失活；②水中的重金屬離子會(hui) 影響酶活力；③水中某些微生物

會(hui) 引起酶失活，除了水中某些“雜質”會(hui) 引起試劑中酶失活、部分失活而導致穩定性、重複性下降

外，有些“雜質”會(hui) 直接影響測定結查，如水中含有 NH4 便會(hui) 直接影響尿素氮測定的準確度。全

液體(ti) 型生化試劑，在使用過程無需任何輔助試劑及蒸餾水，這就保證避免了外源水質而引起的對試

劑的影響，保證了試劑在有效期內(nei) 的穩定和測定結果的可靠。

（四）試劑組分高度均一

試劑中每一組分均一性是影響試劑測定重複性的一個(ge) 重要因素。在幹粉、片劑與(yu) 凍幹生化試劑

生物試劑過程要使每一試劑中十幾種組分（有的組分含量相當微量）分布相對均勻也是一個(ge) 技術難度較

高的課題。在每一種試劑生物試劑過程中必須解決(jue) ：①原料幹粉生物試劑過程中每一組分的均勻性（凍幹生

化試劑在凍幹分裝前由於(yu) 是液體(ti) 的，每個(ge) 組分是相當均勻）。②在分裝過程中由於(yu) 加樣誤差引起的

均勻性問題（這一問題在凍幹分裝過程中同樣存在：在片劑生物試劑過程中體(ti) 現為(wei) 每一片劑重量誤差）。

③在使用過程中，由於(yu) 需加入複溶水，複溶水的加樣誤差也會(hui) 造成瓶與(yu) 瓶之間同一組分濃度不盡一

樣。上述三個(ge) 原因或其中一個(ge) 原因都會(hui) 造成實際測定過程中的瓶間誤差，從(cong) 而引起測定重複性下降。

液體(ti) 型的生化試劑從(cong) 生物試劑到使用全是液態，這就保證了每一個(ge) 組分相對均勻，哪怕是十分微量的組

分，這就避免了實際操作中的誤差，能提高試劑測定的重複性。