MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

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明膠酶譜法試劑盒檢測步驟：

1 製備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為(wei) 8%。按照標準程序製備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，並90 ºC 加熱5分鍾。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 並使之稀釋10倍，混勻後加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

2 待測樣品1:1 稀釋於(yu) 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完後可自行配製：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合後直接上樣。切勿加熱變性，並且僅(jin) 使用不加還原劑的上樣緩衝(chong) 液。可通過預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與(yu) 100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體(ti) 積混合，取5-15μl 上樣。

注：因為(wei) 全血成分複雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為(wei) 20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結束電泳。

4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nei) 。可先用適量蒸餾水衝(chong) 洗凝膠，然後加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鍾。中間換液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應延長孵育時間為(wei) 10小時或過夜。

6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液（操作步驟見後麵所附SDS-PAGE凝膠蛋白質考馬斯亮藍染色液說明書(shu) ）。凝膠的大部分區域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區域。透明區域的位置和範圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現透明條帶。

7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀(yi) 上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景並非真正全黑。解決(jue) 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調整背景顯示為(wei) 灰度顯示，並盡量設置為(wei) 黑色。MMP 條帶則為(wei) 白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

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MMP明膠酶譜試劑盒的正確使用方法-上海信帆生物

使用上海信帆生物明膠酶譜法試劑盒發表的文章：

《綠茶多酚EGCG增強動脈粥樣硬化斑塊穩定性及其相關(guan) 機製研究》

*部分綠茶多酚EGCG增強高脂飲食喂養(yang) ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性目的:急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一係列研究嚴(yan) 重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不穩定型心絞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究資料已證實,急性冠脈綜合征發病的zui主要病理生理基礎是冠狀動脈中不穩定型動脈粥樣硬化斑塊的破裂,引起冠狀動脈內(nei) 急性血栓形成,繼而引起心肌嚴(yan) 重的缺血、缺氧。近年來,多項研究流行病學研究報道稱,飲用綠茶可以明顯降低冠心病的發病率。綠茶的抗動脈粥樣硬化作用主要原因是綠茶中含有大量的多酚類化合物,其中含量zui多的為(wei) 兒(er) 茶素。綠茶中兒(er) 茶素主要成分包括表兒(er) 茶素(EC),表兒(er) 茶素沒食子酸酯(ECG),表沒食子兒(er) 茶素(EGC)和表沒食子兒(er) 茶素沒食子酸酯(EGCG)。在這些成分中,以EGCG含量zui豐(feng) 富,活性zui強,已被證明具有多種藥理學作用和生物學特性。我們(men) 進行本研究主要目的就是為(wei) 了證實綠茶多酚EGCG是否能夠增強高脂飲食喂養(yang) ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性並探討其可能的相關(guan) 機製。

方法:30隻雄性ApoE缺陷小鼠(6周齡,體(ti) 重18-20g)被隨機分為(wei) 對照組(n=15)以及EGCG組(n=15)這些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%膽固醇的高脂飲食喂養(yang) 。EGCG組以及對照組分別給予EGCG(10mg/kg)或者同等劑量的0.9%生理鹽水進行腹腔注射共16周。隨後麻醉處死小鼠,取小鼠頭臂幹動脈並予固定石蠟包埋。小鼠頭臂幹橫切麵進行HE染色以及Masson染色分別評估動脈粥樣硬化斑塊形態以及膠原含量。此外,使用免疫組織化學染色的方法分析小鼠斑塊中巨噬細胞以及平滑肌細胞成分的比例。蛋白質印跡法(Western blot)用來檢測斑塊中蛋白表達水平,明膠酶譜法用來檢測斑塊中基質金屬蛋白酶的活性。

zui後,我們(men) 用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測小鼠血清炎症因子單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及幹擾素-γ(IFN-γ)水平。結果:高脂飲食喂養(yang) 16周後,ApoE缺陷小鼠頭臂幹動脈近端橫切麵HE染色可見明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成,提示造模成功。另外,與(yu) 對照組相比,EGCG組ApoE缺陷頭臂幹動脈近端粥樣硬化病變程度明顯減輕。Masson染色結果提示,EGCG幹預後動脈粥樣硬化斑塊中膠原成分明顯增加。免疫組織化學染色發現EGCG組斑塊中巨噬細胞比例明顯降低,而斑塊中平滑肌成分顯著增高。此外,Western blot檢測發現EGCG可以顯著降低ApoE缺陷小鼠斑塊中基質金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN)的表達。同樣,明膠酶譜法結果提示EGCG組斑塊中MMP-2和-9活性較對照組明顯減低。

zui後,與(yu) 對照組相比,EGCG腹腔注射後,ApoE缺陷小鼠血清炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平顯著降低。結論:本研究結果提示,綠茶多酚EGCG能夠增強高脂飲食喂養(yang) ApoE缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性。此外,EGCG增強斑塊穩定性的內(nei) 在機製可能與(yu) 其抑製多種炎症因子、基質金屬蛋白酶誘導因子以及機製金屬蛋白酶表達有關(guan) 。第二部分EGCG通過與(yu) 67LR相互作用抑製巨噬細胞基質金屬蛋白酶誘導因子以及基質金屬蛋白酶-9的表達目的:大量研究資料表明在不穩定型動脈粥樣硬化破裂過程中,由單核細胞和巨噬細胞分泌的基質金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN)以及基質金屬蛋白酶發揮著十分關(guan) 鍵的作用。表沒食子兒(er) 茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶中zui主要的多酚類化合物,資料顯示EGCG具有多種藥理學活性並且能夠對心血管發揮保護性作用。

近年來,實驗已證實相對分子量為(wei) 67000的層粘連蛋白受體(ti) (67LR)為(wei) EGCG主要膜表麵受體(ti) ,EGCG與(yu) 67LR相互作用後可發揮多種生物學效應。本研究的主要目的就是為(wei) 了評估EGCG是否能夠抑製佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導分化巨噬細胞 EMMPRIN 以及 MMP-9 的表達,並且探討其可能的相關(guan) 機製。方法:使用不同濃度的EGCG預處理人單核細胞THP-1細胞1小時後,以佛波酯(PMA,100nmol/L)誘導48小時使其分化為(wei) 巨噬細胞。實驗中使用小幹擾RNA(Small-interfering RNA,siRNA)沉默EMMPRIN基因表達。實時定量熒光PCR(Real-Time PCR)測定 EMMPRIN 和 MMP-9 mRNA 表達,蛋白質印跡法(Western Blot)檢測EMMPRIN以及MMP-9蛋白表達,使用明膠酶譜法檢測MMP-9的活性。

結果:研究發現EGCG(10-50μmol/L)可以明顯抑製巨噬細胞EMMPRIN以及MMP-9的表達,抑製作用呈現劑量-效應關(guan) 係,隨著EGCG濃度的增加,其抑製作用明顯增強。Extracellular signal-regulated kinase 1/2(ERK1/2)、p38 以及c-Jun N-terminal kinase(JNK)信號通路與(yu) EMMPRIN和MMP-9的表達密切相關(guan) ,EGCG同樣能夠顯著抑製ERK1/2、p38以及JNK信號轉導通路的激活。

使用基因沉默的方法下調巨噬細胞EMMPRIN表達可以使MMP-9的表達以及活性明顯下降,提示在EGCG主要通過抑製巨噬細胞EMMPRIN合成進而抑製MMP-9的表達。為(wei) 了進一步證明EGCG是否通過67LR相互作用發揮其抑製EMMPRIN以及MMP-9表達的作用,我們(men) 使用67LR抗體(ti) 封閉巨噬細胞表麵67LR以阻斷EGCG與(yu) 67LR的相互作用,結果發現EGCG對巨噬細胞EMMPRIN以及MMP-9表達的抑製作用明顯減弱,同樣67LR抗體(ti) 阻斷了 EGCG對於(yu) ERK1/2、p38以及JNK信號轉導通路的抑製作用。

結論:我們(men) 的研究結果表明,EGCG可以通過抑製ERK1/2、p38以及JNK信號轉導通路的激活進而降低巨噬細胞EMMPRIN和MMP-9表達,這些生物學效應是通過EGCG與(yu) 67LR相互作用介導的。另外,研究發現在EGCG抑製MMP-9表達的過程中,EMMPRIN發揮著主要作用。以上研究結果提示綠茶多酚EGCG可能成為(wei) 一種穩定動脈粥樣硬化斑塊的治療劑。

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