PI活細胞/死細胞雙染試劑盒*啦

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Calcein-AM是一種對活細胞進行熒光標記的細胞染色試劑，發綠色熒光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在傳(chuan) 統的Calcein（鈣黃綠素）基礎上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基團，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細胞膜。一旦進入細胞後，Calcein-AM（本身不發熒光）被細胞內(nei) 的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從(cong) 而被滯留在細胞內(nei) 並發出強綠色熒光。與(yu) 其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由於(yu) Calcein, AM細胞毒性極低，是適合用於(yu) 活細胞染色的熒光探針，而且不會(hui) 抑製任何的細胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由於(yu) 死細胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅(jin) 用於(yu) 對活細胞的細胞生存能力測試和短期標記。因此，Calcein-AM常常與(yu) 死細胞熒光探針如碘化丙啶（PI）等聯合使用，同時進行活細胞和死細胞的熒光雙重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿過活細胞的細胞膜，僅(jin) 能穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，並嵌入細胞的DNA雙螺旋從(cong) 而產(chan) 生紅色熒光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI僅(jin) 對死細胞染色。由於(yu) Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發，僅(jin) 可觀察到死細胞。

本試劑盒的工作原理就在於(yu) Calcein-AM和PI的雙重染料，來進行活細胞和死細胞的雙重染色標記，從(cong) 而進行活細胞和死細胞水平的分析。根據我司優(you) 化的實驗體(ti) 係，單次就200µl細胞懸液進行染色，分別可以做500次和1000次檢測。

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產(chan) 品組分

運輸和保存方法

其中A組分和B組分需-20℃避光幹燥保存，C組分-20℃保存，經常使用可放在4℃保存。一年有效。

使用方法

1. 工作液的配製

1.1  1×Assay Buffer（反應緩衝(chong) 液）的配製

從(cong) 低溫冰箱內(nei) 取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH₂O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2  1×染色工作液的配製

1）先將低溫保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液（1.5 mM）回到室溫20-30min。

【注意】：次使用可對母液進行分裝，以減少反複凍融次數。

2）取5µl Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時得到Calcein-AM的工作液濃度為(wei) 2μM，PI的工作液濃度為(wei) 4.5μM。由於(yu) 不同細胞係的佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定 Calcein-AM和PI的適濃度。梯度篩選的原則為(wei) 使用低的探針濃度得到好的熒光結果。

【注意】：由於(yu) Calcein-AM的穩定性比較差，此染色工作液必須現配現用，並且在當天用完。

2. 染色步驟

2.1 對於(yu) 貼壁細胞，先用細胞刮刀或者胰酶-EDTA消化細胞，之後離心收集細胞（1000 rpm，3min）。

對於(yu) 懸浮細胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細胞。

2.2 去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3 用1×Assay Buffer製備細胞懸液，使其密度為(wei) 1×10⁵~1×10⁶細胞/ml。

2.4 取100µl染色工作液加入200µl細胞懸液內(nei) ，混勻，37℃孵育15min。

【注意】：如果需要，可延長孵育時間至30min。

2.5 熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發濾片同時檢測活細胞（黃綠色熒光）以及死細胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發射濾片僅(jin) 能觀察到死細胞。也可以直接在熒光酶標儀(yi) 下使用合適的濾片進行檢測。

【注意】：可以使用以下方法來優(you) 化得到兩(liang) 種熒光染料的佳工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細胞10min，或者用70%乙醇孵育細胞30min，從(cong) 而製備死細胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液進行死細胞染色，以得到僅(jin) 僅(jin) 對細胞核染色，而不會(hui) 對細胞質染色的佳工作濃度。

c) 用0.1-10µM的Calcein-AM進行死細胞染色，以得到不會(hui) 對細胞質染色的佳工作濃度。然後用此濃度進行活細胞染色，去觀察是否活細胞能被染色。

注意事項

1）由於(yu) Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量後，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。

3）為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作。

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