JC-1法檢測線粒體膜電位，以及檢測線粒體膜電位的操作步驟

JC-1法檢測線粒體(ti) 膜電位，以及檢測線粒體(ti) 膜電位的操作步驟！

線粒體(ti) 膜電位檢測試劑盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以 JC-1 為(wei) 熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體(ti) 膜電位變化的試劑盒，可以用於(yu) 早期的細胞凋亡檢測，CCCP 作為(wei) 誘導線粒體(ti) 膜電位下降的陽性對照。該試劑盒僅(jin) 用於(yu) 科研領域，不宜用於(yu) 研究診斷或其他用途。

產(chan) 品組成：

操作步驟(僅(jin) 供參考)：

1、配製 JC-1 染色工作液：

取適量 JC-1 Stain (200×)，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH₂O 的比例稀釋 JC-1，劇烈 Vortex 充分溶解並混勻 JC-1 Stain。然後再加入 2ml JC-1 Buffer(5×)，

混勻後即為(wei) JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為(wei) 1ml，其它培養(yang) 器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推；對於(yu) 細胞懸液每 0.5～1.0×10⁶ 細胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

2、設置陽性對照：

推薦 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到細胞培養(yang) 液中，稀釋至 10μM，處理細胞20min。隨後按照下述方法裝載 JC-1，進行線粒體(ti) 膜電位的檢測。對於(yu) 大多數細胞，通常 10μM CCCP 處理 20min 後線粒體(ti) 的膜電位會(hui) *喪(sang) 失，JC-1 染色後觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經 JC-1 染色後應顯示紅色熒光。對於(yu) 特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guan) 文獻資料確定。

3、對於(yu) 懸浮細胞：

• 取 1～6×10⁵ 細胞，重懸於 0.5ml 細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅。

• 加入 0.5ml JC-1 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例，配製適量的 JC-1 Buffer(1×)，並放置於冰浴。

• 37℃孵育結束後， 4℃ 600g 離心 3～4min，沉澱細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

• 用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細胞，4℃ 600g 離心3～4min，沉澱細胞，棄上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細胞，4℃ 600g 離心

3～4min，沉澱細胞，棄上清。

• 再用少量 JC-1 Buffer(1×)重懸後，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

JC-1法檢測線粒體(ti) 膜電位，以及檢測線粒體(ti) 膜電位的操作步驟！

4、對於(yu) 貼壁細胞：

注意：對於(yu) 貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀(yi) 檢測，應先收集細胞，重懸後參考懸浮細胞的檢測方法。

• 吸除 6 孔板培養液，根據具體實驗如有必要可以用 PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入 1ml 細胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅。

• 加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例，配製適量的 JC-1 Buffer(1×)，並放置於冰浴。

• 37℃孵育結束後，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次。

• 加入 2ml 細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。

• 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對於(yu) 純化的線粒體(ti) ：

• 把配製好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1×)稀釋 5 倍。

• 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

• 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻後直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發波長為 485nm，發射波長為 590nm。如果使用熒光酶標儀，激發波長不能設置為 485nm 時，可以在 475～520nm 範圍內設置激發波長。另外，也可以參考下麵步驟 6

中的波長設置進行熒光檢測。 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下麵的步驟 6。

6、熒光觀測和結果分析：

檢測 JC-1 單體(ti) 時可以把激發光設置為(wei) 490nm，發射光設置為(wei) 530nm；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發光設置為(wei) 525nm，發射光設置為(wei) 590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在zui大激發波長和zui大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 單體(ti) 時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設置；檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設置。出現綠色熒光說明線粒體(ti) 膜電位下降，並且該細胞很可能處於(yu) 細胞凋亡早期。出現紅色熒光說明線粒體(ti) 膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

注意事項：

1、 JC-1 Stain(200×)應*溶解混勻後使用，但應避免反複凍融。必須先把 JC-1 用 ddH₂O 充分溶解混勻後，才可加入 JC-1 Buffer(1×)。不可先配製 JC-1 Buffer(1×)再加入

JC-1 Stain(200×)，否則導致 JC-1 很難充分溶解，嚴(yan) 重影響後續的檢測。

2、 對於(yu) 6 孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個(ge) 樣品；對於(yu) 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個(ge) 樣品。

3、 裝載完 JC-1 後用 JC-1 Buffer(1×)洗滌時，盡量使 JC-1 Buffer(1×)保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

4、 JC-1 探針裝載完並洗滌後盡量在 30min 內(nei) 完成後續檢測，在檢測前需冰浴保存。

5、 勿把 JC-1 Buffer(5×)全部配製成 1×，因為(wei) 操作過程中需直接使用 JC-1 Buffer(5×)。6、 如 JC-1 Buffer(5×)中有沉澱，必須全部溶解後才能使用，為(wei) 促進溶解可以在 37℃加熱。7、 CCCP 為(wei) 線粒體(ti) 電子傳(chuan) 遞鏈抑製劑，有一定毒性，請注意小心防護。

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