中性蛋白酶檢測試劑盒使用說明書

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中性蛋白酶（Neutral protease, NP）活性測定試劑盒說明書(shu)

測定意義(yi) ：
NP 在一定的溫度和中性pH 條件下，催化水解蛋白質。由於(yu) 其安全無毒、水解能力強、作
用範圍廣等特點，中性蛋白酶常用於(yu) 食品、飼料、化妝品和營養(yang) 保健品生物試劑。
測定原理：
中性條件下，NP 催化酪蛋白水解產(chan) 生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生
成鎢藍；在680nm 有特征吸收峰。
自備儀(yi) 器和用品：
可見分光光度計/酶標儀(yi) 、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、
1.5 mL EP 管和蒸餾水。
試劑組成和配製：
試劑一：液體(ti) 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨(lin) 用前加4mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨(lin) 用前加入4mL 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。
試劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨(lin) 用前加20mL 蒸餾水溶解。
試劑五：液體(ti) 4mL×1 瓶，4℃保存。
標準品：液體(ti) 1mL×1 支，0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，
加入1mL 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培養(yang) 液：直接測定。
3. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1 的比例（建
議500 萬(wan) 細胞加入1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3 秒，間隔7
秒，總時間3min）；然後8000g，4℃，離心10min，取上清置於(yu) 冰上待測。
測定操作：
1. 分光光度計/酶標儀(yi) 預熱30min，調節波長到680 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑二、試劑三和試劑四置於(yu) 30℃水浴保溫30min。
3. 對照管：取0.5 mL EP 管，加入20μL 粗酶液，40μL 試劑二，混勻後置於(yu) 30℃水浴保溫
10min；加入40μL 試劑三，混勻後8000g，4℃離心10min；取40μL 上清液，加入新的EP
管，再加入200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻後置於(yu) 30℃水浴保溫20min，取200μL 於(yu) 微
量玻璃比色皿/96 孔板，於(yu) 680nm 測定光吸收，記為(wei) A 對照管。
4. 測定管：取0.5 mL EP 管，加入20μL 粗酶液，40μL 試劑三，混勻後置於(yu) 30℃水浴保溫
10min；加入40μL 試劑二，混勻後8000g， 4℃離心10min；取40μL 上清液，加入新的EP
管，再加入200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻後置於(yu) 30℃水浴保溫20min，取200μL 於(yu) 微
量玻璃比色皿/96 孔板，於(yu) 680nm 測定光吸收，記為(wei) A 測定管。（注意與(yu) 空白管不同，先加
試劑三，後加試劑二）
5. 空白管：取0.5 mL EP 管，加入40μL 蒸餾水，200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻後置於(yu)
30℃水浴保溫20min，取200μL 於(yu) 微量玻璃比色皿/96 孔板，於(yu) 680nm 測定光吸收，記為(wei) A
空白管。
6. 標準管：取0.5 mL EP 管，加入40μL 標準品，200μL 試劑四，40μL 試劑五，混勻後置於(yu)

30℃水浴保溫20min，取200μL 於(yu) 微量玻璃比色皿/96 孔板，於(yu) 680nm 測定光吸收，記為(wei) A
標準管。
注意：空白管和標準管隻需要測定一次。

中性蛋白酶檢測試劑盒使用說明書(shu) 計算公式：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每毫克蛋白每分鍾水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每克樣品每分鍾催化水解產(chan) 生1 nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W
（3）按照液體(ti) 體(ti) 積計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每毫升樣品每分鍾催化水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×
稀釋倍數÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
（4）按照細胞數量計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每104 個(ge) 細胞每分鍾催化水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /104 cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數÷（細胞數量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白
管）÷細胞數量
C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液
蛋白質濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用於(yu) 蛋白質含量測定，需要另外測定；建議
稱取同樣質量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心後，用本公司蛋白質含量測定試劑盒
測定；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體(ti) 係中粗酶液體(ti) 積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：
粗酶液總體(ti) 積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min。
b.使用96 孔板測定的計算公式如下
（1）按蛋白濃度計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每毫克蛋白每分鍾水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr
（2）按樣本質量計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每克樣品每分鍾催化水解產(chan) 生1 nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
×稀釋倍數÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W
（3）按照液體(ti) 體(ti) 積計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每毫升樣品每分鍾催化水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×
稀釋倍數÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）
（4）按照細胞數量計算
NP 活性單位定義(yi) ：30℃每104 個(ge) 細胞每分鍾催化水解產(chan) 生1nmol 酪氨酸為(wei) 1 個(ge) 酶活單位。
NP 活性（nmol/min /104 cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）


×稀釋倍數÷（細胞數量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白
管）÷細胞數量
C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液
蛋白質濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用於(yu) 蛋白質含量測定，需要另外測定；建議
稱取同樣質量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心後，用本公司蛋白質含量測定試劑盒
測定；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體(ti) 係中粗酶液體(ti) 積（mL），20μL=2×10-2 mL；V2：
粗酶液總體(ti) 積（mL），1mL；T：催化反應時間（min），10min。
注意事項：
臨(lin) 用前配製的試劑配製好後4℃保存，並且3 天內(nei) 使用完畢。

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