明膠酶譜法原理:
酶譜法的基本過程是先將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE,含0.1%明膠)電泳分離,然後在有二價金屬離子存在的緩衝係統中使樣品中的MMP-2(基質金屬蛋白酶-2)和MMP-9恢複活性,在各自的遷移位置水解凝膠裏的明膠,zui後用考馬斯亮藍將凝膠染色,再脫色,在藍色背景下可出現白色條帶,條帶的強弱與MMP-2和MMP-9活性成正比。
複性原理:在電泳過程中,SDS與樣品中的MMPs結合(當然是可逆性結合),破壞其氫鍵、疏水鍵而使MMPs不能發揮其分解明膠的作用,而隻有當將膠置Trition中洗脫(是放在搖床上搖,30min/次,做2次或15min/次,4次。靜置於Trition中是不妥的)時,由於SDS被Trition結合而去除,從而使MMPs恢複了活性。
1、製備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。
2、明膠酶譜的活性受鈣離子,鋅離子,和PH值等因素的影響,因此緩衝液配製應嚴格準確,盡量用超純水,孵育溫度也掌握好。
3、用大梳子。
4、孵育液的PH在7.5-7.6,複性的TRITON時間長了會有絮狀物,所以實驗時盡量使用新鮮配置的。
5、孵育的37度不要在CO2培養箱中,因為會改變孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
6、明膠要4度保存,配好後1周內使用。