elisa試劑盒操作適合常見問題分析

   ky体育在线登陆測定的主要原理是利用抗原、抗體(ti) 之間的特異反應通過某一種或幾種酶來連接待測物，通過底物和酶的相互作用，會(hui) 改變溶液的顏色，進而通過觀察溶液顏色來判定測定的結果。在生物學科的研究中，ELISA是zui為(wei) 常用，也是zui為(wei) 重要的一種生物指標檢測方法。信帆生物的技術人員根據自己多年的經驗，針對ELISA測定實踐中存在的常見問題及其發生原因進行剖析，具體(ti) 分析如下。 

1 假陰性出現的原因分析及建議： 
　　導致假陰性的原因主要包括以下幾種情況，①如果檢測大批量樣本，實驗室檢測人員的工作量比較大，有時候可能觀察樣本呈色不及時，很多樣本在實驗者觀察時，結果已經褪色，導致樣本呈現假陰性。②試劑自身的質量並沒有達標，比如已經過了保質期，試劑保存的方法不恰當，在試劑運輸的過程中，破壞了樣本，蒸餾質存在其他混合物。如果缺乏陰陽對比，極易出現假陰性。③溫育、溫度不充分，作用時間過短，忘記添加底物顯色劑或者酶標二抗等，這些原因都可能導致出現假陰性。④部分生物試劑試劑廠家經濟條件較差，儀(yi) 器、設備等比較落後，特別是若為(wei) 人工包被的話，和普通試劑相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出現“漏包”、抗體(ti) （抗原）失去活性或活性不足等現象，進而出現假陰性。⑤在檢測的過程中，加樣技術非常重要，由於(yu) ELISA 測定法僅(jin) 僅(jin) 是微量樣品，如果多加1ul樣品或者少加1ul樣品，極易導致檢測標本的測定結果一時陽性，一時陰性。 
　　2 樣本假陽性的原因分析及其建議： 
　　導致樣本出現假陽性的原因主要包括以下幾種情況： 
　　

     2.1 吸附作用。很多SLE或者類風濕等具有自身免疫疾病患者，他們(men) 的血清中常常會(hui) 存一些特殊組成成分對樣本測定的結果準確性造成影響，比如在包被板上會(hui) 輕微吸附著一些IgG 抗體(ti) ，這些附著的IgG抗體(ti) 會(hui) 導致之前顯示陰性樣本顯色，這種情況顯然是失真的。如果遇到這種情況建議結合樣本具體(ti) 情況進行判斷，並且應該在樣本測定結果中標注特殊情況。 
　　2.2 標本中雜質的影響。在檢測標本中，如果血液樣本黏稠度過高，血清脂質含量、膽紅素含量、血紅蛋白含量等過高，都會(hui) 幹擾ELISA測定結果，出現假陽性結果。 
　　2.3 內(nei) 源性物質。據相關(guan) 數據統計^[3]，大約有40%左右的學者認為(wei) 樣本血清中都存在某些對ELISA測定結果存在交叉反應物質、醫源性誘導抗鼠Ig（s）抗體(ti) 、嗜異性抗體(ti) 、補體(ti) 、類風濕因子或者其他幹擾作用物質等，在一定程度上會(hui) 幹擾樣本測定結果的準確性，會(hui) 導致樣本檢測結果出現假陽性。 
　　2.4 外源性物質。在采集樣本和保存樣本的過程中，常常會(hui) 由於(yu) 實驗室操作人員操作不規範而導致樣本測定結果出現假陽性。比如：①樣本溶血現象。這種問題常常是由於(yu) 人為(wei) 操作因素所致，在破壞溶解紅細胞過程中會(hui) 產(chan) 生大量血紅蛋白，ELISA的標記主要以辣根過氧化物酶為(wei) 主，而這些血紅蛋白的過氧化物酶活性較強，因此一旦采集標本出現溶血現象，會(hui) 出現非特異性顯色反應，導致樣本檢測出現假陽性現象。因此研究檢驗實踐中應重視標本溶血問題。②保存標本的方法不恰當，如果存放存標本的時間在1d以上，則很容易導致標本活性喪(sang) 失或大大降低，出現假陰性問題。如果標本待檢時間過長，標本血清中IgG 抗體(ti) 極易形成多聚體(ti) ，而AFP抗體(ti) 極易形成二聚體(ti) ，二聚體(ti) 和多聚體(ti) 相互結合極易導致本底過深，進而使樣本測定結果出現假陽性。因此在研究檢測過程中，應該在zui短的時間內(nei) 進行ELISA 測定，如果由於(yu) 特殊情況必須將測定時間延長，則應該將標本存放環境設定為(wei) 4℃恒溫（5d內(nei) ）。若標本在7d後檢測，應采取低溫冷凍處理，在檢測前再測解凍，並輕輕充分搖勻後測定。 
　　2.5 並沒有全麵凝集標本。由於(yu) 血液采集後在30min-2h後逐漸開始凝固，在24h左右會(hui) *凝固，因此在ELISA 檢測過程中，常常會(hui) 在血液標本中適當添加一些促凝劑或抗凝劑，為(wei) 了爭(zheng) 取有效的檢測時間會(hui) 強行將血清分離出來。此時血清中仍然有部分纖維蛋白原殘留，並極易形成纖維蛋白塊，這些肉眼可見的纖維蛋白塊會(hui) 使實驗者判斷失誤，導致樣本測定出現假陽性。這種問題其實比較好解決(jue) ，導致這種現象的主要原因是血液還沒有*凝固所致，研究檢測時隻需要待血液*凝固後分離血清即可。如果特殊情況下需要快速檢測，則應該使用分離膠采血管或者加入一定量促凝劑。 

　　3 檢測操作誤差： ELISA 測定基本上都是手工操作，會(hui) 無可避免的存在某些誤差，如果樣品加入時間，加入試劑以及混合時間存在出入，極易造成操作時差。在操作過程中，應在加樣後輕輕混合均勻，不能混用不同批號試劑，試劑瓶和試劑蓋應仔細檢查，避免出現張冠李戴現象。應確保試劑保存的溫度、保存時間、洗滌方法、顯色條件等保持一致，在檢測時應注意避免試劑、樣本、板以及吸頭汙染。若在閾值附近出現檢測結果時陰時陽現象，不要急於(yu) 做出判斷，應重複多次進行檢測，zui終的檢測結果應以偶數結果為(wei) 判定標準。 
　　根據以上常見問題及其原因的分析，主要存在樣本測定結果假陰性、假陽性等問題，應綜合考慮人為(wei) 操作因素、試劑因素、標本因素等多方麵影響，及早查明影響ELISA 測定的根本原因，並及時糾正進行重新測定，確保ELISA 測定結果的準確性、可靠性，為(wei) 研究提供科學依據。